Mechanostimulatie van meercellige organismen via een microfluïdisch compressiesysteem met hoge doorvoer
Summary
Het huidige protocol beschrijft het ontwerp, de fabricage en de karakterisering van een microfluïdisch systeem dat in staat is om honderden Drosophila melanogaster-embryo’s uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig te comprimeren met minimale tussenkomst van de gebruiker. Dit systeem maakt beeldvorming met hoge resolutie en herstel van monsters mogelijk voor poststimulatieanalyse en kan worden geschaald om plaats te bieden aan andere meercellige biologische systemen.
Abstract
Tijdens embryogenese genereert gecoördineerde celbeweging mechanische krachten die genexpressie en -activiteit reguleren. Om dit proces te bestuderen, zijn hulpmiddelen zoals aspiratie of coverslipcompressie gebruikt om hele embryo’s mechanisch te stimuleren. Deze benaderingen beperken experimenteel ontwerp omdat ze onnauwkeurig zijn, handmatige hantering vereisen en slechts een paar embryo’s tegelijkertijd kunnen verwerken. Microfluïdische systemen hebben een groot potentieel voor het automatiseren van dergelijke experimentele taken terwijl ze de doorvoer en precisie verhogen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch systeem dat is ontwikkeld om hele Drosophila melanogaster (fruitvlieg) embryo’s nauwkeurig te comprimeren. Dit systeem beschikt over microkanalen met pneumatisch bediende vervormbare zijwanden en maakt embryo-uitlijning, immobilisatie, compressie en verzameling na stimulatie mogelijk. Door deze microkanalen in zeven rijstroken te parallelliseren, kunnen stabiele of dynamische compressiepatronen tegelijkertijd op honderden Drosophila-embryo’s worden toegepast. Het fabriceren van dit systeem op een glazen coverslip vergemakkelijkt de gelijktijdige mechanische stimulatie en beeldvorming van monsters met microscopen met hoge resolutie. Bovendien maken het gebruik van biocompatibele materialen, zoals PDMS, en de mogelijkheid om vloeistof door het systeem te laten stromen, dit apparaat in staat tot langdurige experimenten met media-afhankelijke monsters. Deze aanpak elimineert ook de vereiste voor handmatige montage die monsters mechanisch belast. Bovendien maakt de mogelijkheid om snel monsters uit de microkanalen te verzamelen poststimulatieanalyses mogelijk, inclusief -omics-assays die grote steekproefaantallen vereisen die onbereikbaar zijn met behulp van traditionele mechanische stimulatiebenaderingen. De geometrie van dit systeem is gemakkelijk schaalbaar naar verschillende biologische systemen, waardoor tal van velden kunnen profiteren van de hierin beschreven functionele kenmerken, waaronder een hoge monsterdoorvoer, mechanische stimulatie of immobilisatie en geautomatiseerde uitlijning.
Introduction
Levende systemen ervaren en reageren voortdurend op verschillende mechanische inputs gedurende hun hele levensduur1. Mechanotransductie is in verband gebracht met vele ziekten, waaronder ontwikkelingsstoornissen, spier- en botverlies en neuropathologieën via signaalroutes die direct of indirect worden beïnvloed door de mechanische omgeving2. De genen en eiwitten die worden gereguleerd door mechanische stimulatie3 in de mechanosensitive signaling pathways4 blijven echter grotendeels onbekend5, waardoor de opheldering van de mechanische regulatiemechanismen en de identificatie van moleculaire doelwitten voor ziekten geassocieerd met pathologische mechanotransductie wordt voorkomen 6,7 . Een beperkende factor bij het projecteren van mechanobiologische studies op de gerelateerde fysiologische processen is het gebruik van individuele cellen met conventionele kweekschalen in plaats van intacte meercellige organismen. Modelorganismen, zoals Drosophila melanogaster (fruitvlieg), hebben sterk bijgedragen aan het begrijpen van de genen, signaalroutes en eiwitten die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dieren 8,9,10. Niettemin is het gebruik van Drosophila en andere meercellige modelorganismen in mechanobiologisch onderzoek belemmerd door uitdagingen met experimentele hulpmiddelen. Conventionele technieken voor het voorbereiden, sorteren, in beeld brengen of toepassen van verschillende stimuli vereisen meestal handmatige manipulatie; deze benaderingen zijn tijdrovend, vereisen expertise, introduceren variabiliteit en beperken het experimentele ontwerp en de steekproefgrootte11. Recente microtechnologische ontwikkelingen zijn een geweldige bron voor het mogelijk maken van nieuwe biologische testen met een zeer hoge doorvoer en zeer gecontroleerde experimentele parameters 12,13,14.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van een verbeterd microfluïdisch apparaat om mechanische stimulatie in de vorm van uniaxiale compressie uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig toe te passen op honderden hele Drosophila-embryo’s 15 (figuur 1). Integratie van het microfluïdische systeem met een glazen afdekplaat maakte een hoge resolutie confocale beeldvorming van de monsters tijdens de stimulatie mogelijk. Het microfluïdische apparaat maakte ook een snelle verzameling van de embryo’s mogelijk na de stimulatie voor het uitvoeren van -omics-testen (figuur 2). Uitleg over de ontwerpoverwegingen van dit apparaat, evenals de fabricage met behulp van zachte lithografie en experimentele karakterisering, worden hierin beschreven. Omdat het maken van een siliciumwafermal van een dergelijk apparaat een uniforme coating van dikke fotoresist (dikte > 200 μm) vereist over grote oppervlakken met hoge beeldverhouding (AR) sleuven (AR >5), heeft deze methode het traditionele fotolithografische matrijsfabricageprotocol aanzienlijk gewijzigd. Op deze manier vergemakkelijkte deze methode de hantering, hechting, coating, patroonvorming en ontwikkeling van de fotoresist. Daarnaast worden mogelijke valkuilen en hun oplossingen besproken. Ten slotte werd de veelzijdigheid van deze ontwerp- en fabricagestrategie aangetoond met behulp van andere meercellige systemen zoals Drosophila-eikamers en hersenorganoïden16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het artikel beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdisch apparaat om automatisch uit te lijnen, te immobiliseren en nauwkeurig mechanische stimulatie toe te passen op honderden hele Drosophila-embryo’s . De integratie van het microfluïdische systeem met een dunne glazen afdekplaat maakte het mogelijk om embryo’s met hoge resolutie confocale microscopie tijdens de stimulatie in beeld te brengen. Het microfluïdische apparaat maakte ook de verzameling van de embryo’s direct na de stimulatie mogelijk voor he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (CMMI-1946456), het Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) en het National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -. C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al., Patrinos, G., et al. Chapter 11 – Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. , 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. . Drosophila. A Laboratory Handbook. , (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
