Mecanoestimulação de organismos multicelulares através de um sistema de compressão microfluídica de alto rendimento
Summary
O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.
Abstract
Durante a embriogênese, o movimento celular coordenado gera forças mecânicas que regulam a expressão e a atividade gênica. Para estudar esse processo, ferramentas como aspiração ou compressão de deslizamento de cobertura têm sido usadas para estimular mecanicamente embriões inteiros. Essas abordagens limitam o projeto experimental, pois são imprecisas, exigem manuseio manual e podem processar apenas alguns embriões simultaneamente. Os sistemas microfluídicos têm um grande potencial para automatizar essas tarefas experimentais e, ao mesmo tempo, aumentar a produtividade e a precisão. Este artigo descreve um sistema microfluídico desenvolvido para comprimir com precisão embriões inteiros de Drosophila melanogaster (mosca da fruta). Este sistema possui microcanais com paredes laterais deformáveis acionadas pneumaticamente e permite o alinhamento embrionário, imobilização, compressão e coleta pós-estimulação. Ao paralelizar esses microcanais em sete faixas, padrões de compressão constantes ou dinâmicos podem ser aplicados a centenas de embriões de Drosophila simultaneamente. A fabricação deste sistema em uma tampa de vidro facilita a estimulação mecânica simultânea e a imagem de amostras com microscópios de alta resolução. Além disso, a utilização de materiais biocompatíveis, como o PDMS, e a capacidade de fluir fluido através do sistema tornam este dispositivo capaz de experimentos de longo prazo com amostras dependentes de mídia. Essa abordagem também elimina a necessidade de montagem manual que tensiona mecanicamente as amostras. Além disso, a capacidade de coletar rapidamente amostras dos microcanais permite análises pós-estimulação, incluindo ensaios -ômicos que exigem um grande número de amostras inatingíveis usando abordagens tradicionais de estimulação mecânica. A geometria deste sistema é facilmente escalável para diferentes sistemas biológicos, permitindo que vários campos se beneficiem das características funcionais aqui descritas, incluindo alto rendimento da amostra, estimulação mecânica ou imobilização e alinhamento automatizado.
Introduction
Os sistemas vivos experimentam e respondem constantemente a várias entradas mecânicas ao longo de suas vidas1. A mecanotransdução tem sido associada a muitas doenças, incluindo distúrbios do desenvolvimento, perda muscular e óssea e neuropatologias através de vias de sinalização direta ou indiretamente afetadas pelo ambiente mecânico2. No entanto, os genes e proteínas regulados pela estimulação mecânica3 nas vias de sinalização mecanossensíveis4 permanecem em grande parte desconhecidos5, impedindo a elucidação dos mecanismos de regulação mecânica e a identificação de alvos moleculares para doenças associadas à mecanotransdução patológica 6,7 . Um fator limitante na projeção de estudos de mecanobiologia nos processos fisiológicos relacionados é o uso de células individuais com placas de cultura convencionais em vez de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como a Drosophila melanogaster (mosca da fruta), têm contribuído sobremaneira para a compreensão dos genes, vias de sinalização e proteínas envolvidas no desenvolvimento animal 8,9,10. No entanto, o uso de Drosophila e outros organismos modelo multicelulares na pesquisa em mecanobiologia tem sido dificultado por desafios com ferramentas experimentais. Técnicas convencionais para preparar, classificar, fazer imagens ou aplicar vários estímulos requerem principalmente manipulação manual; essas abordagens são demoradas, exigem experiência, introduzem variabilidade e limitam o desenho experimental e o tamanho da amostra11. Os recentes avanços microtecnológicos são um grande recurso para permitir novos ensaios biológicos com rendimento muito alto e parâmetros experimentais altamente controlados12,13,14.
Este artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico aprimorado para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica na forma de compressão uniaxial a centenas de embriões inteiros de Drosophila 15 (Figura 1). A integração do sistema microfluídico com uma tampa de vidro permitiu imagens confocais de alta resolução das amostras durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também possibilitou a coleta rápida dos embriões após a estimulação para ensaios de corrida -ômica (Figura 2). Explicações sobre as considerações de projeto deste dispositivo, bem como a fabricação usando litografia suave e caracterização experimental, são descritas aqui. Uma vez que a fabricação de um molde de wafer de silício de tal dispositivo requer um revestimento uniforme de fotorresistência espessa (espessura >200 μm) em grandes áreas com trincheiras de alta proporção (AR) (AR >5), esse método modificou consideravelmente o protocolo tradicional de fabricação de moldes fotolitográficos. Desta forma, este método facilitou o manuseio, adesão, revestimento, padronização e desenvolvimento do fotorresistente. Além disso, possíveis armadilhas e suas soluções são discutidas. Por fim, a versatilidade dessa estratégia de projeto e fabricação foi demonstrada por meio de outros sistemas multicelulares, como câmaras de ovos de Drosophila e organoides cerebrais16.
Protocol
Representative Results
Discussion
O artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica a centenas de embriões inteiros de Drosophila . A integração do sistema microfluídico com uma fina tampa de vidro permitiu a imagem de embriões com microscopia confocal de alta resolução durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também permitiu a coleta dos embriões logo após a estimulação para ensaios biológicos a jusante. As considerações de de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (CMMI-1946456), pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (FA9550-18-1-0262) e pelo Instituto Nacional de Saúde (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
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