고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극
Summary
본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.
Abstract
배아 발생 동안 조정 된 세포 이동은 유전자 발현과 활성을 조절하는 기계적 힘을 생성합니다. 이 과정을 연구하기 위해 흡인 또는 커버 슬립 압축과 같은 도구를 사용하여 전체 배아를 기계적으로 자극했습니다. 이러한 접근 방식은 부정확하고 수동 처리가 필요하며 동시에 몇 개의 배아만 처리할 수 있으므로 실험 설계를 제한합니다. 미세 유체 시스템은 처리량과 정밀도를 높이면서 이러한 실험 작업을 자동화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기사에서는 전체 초 파리 멜라노가스터(초 파리) 배아를 정밀하게 압축하기 위해 개발된 미세 유체 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 공압으로 작동되는 변형 가능한 측벽이 있는 마이크로채널을 특징으로 하며 배아 정렬, 고정화, 압축 및 자극 후 수집을 가능하게 합니다. 이러한 마이크로 채널을 7 개의 레인으로 병렬화함으로써 꾸준하거나 역동적 인 압축 패턴을 수백 개의 초파리 배아에 동시에 적용 할 수 있습니다. 유리 커버슬립에 이 시스템을 제작하면 고해상도 현미경으로 샘플을 동시에 기계적 자극과 이미징할 수 있습니다. 또한 PDMS와 같은 생체 적합성 재료를 활용하고 시스템을 통해 유체를 흐르게 하는 기능으로 인해 이 장치는 매체 의존형 샘플로 장기간 실험할 수 있습니다. 이 접근 방식은 또한 기계적으로 시료에 스트레스를 주는 수동 장착의 필요성을 제거합니다. 또한 마이크로채널에서 샘플을 신속하게 수집할 수 있는 기능은 기존의 기계적 자극 접근 방식으로는 얻을 수 없는 많은 샘플 수를 필요로 하는 -omics 분석을 포함하여 자극 후 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템의 기하학적 구조는 다양한 생물학적 시스템으로 쉽게 확장 가능하여, 많은 분야가 높은 샘플 처리량, 기계적 자극 또는 고정화, 및 자동 정렬을 포함하여 여기에 설명된 기능적 특징으로부터 이익을 얻을 수 있도록 합니다.
Introduction
살아있는 시스템은 일생 동안 다양한 기계적 입력을 지속적으로 경험하고 반응합니다1. 기계 변환은 발달 장애, 근육 및 뼈 손실,기계적 환경에 의해 직간접적으로 영향을 받는 신호 경로를 통한 신경병리를 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다2. 그러나 기계감응성 신호전달 경로4에서 기계적 자극3에 의해 조절되는 유전자와 단백질은크게 알려지지 않은 상태로 남아 있으며5, 기계적 조절 메커니즘의 해명 및 병리학적 기계변환과 관련된 질병에 대한 분자 표적의 식별을 방해합니다.6,7 . 기계 생물학 연구를 관련 생리적 과정에 투영하는 데있어 한 가지 제한 요소는 손상되지 않은 다세포 유기체 대신 기존 배양 접시가있는 개별 세포를 사용하는 것입니다. 초파리 멜라노가스터(초파리)와 같은 모델 유기체는 동물 발달에 관여하는 유전자, 신호 경로 및 단백질을 이해하는 데 크게 기여했습니다 8,9,10. 그럼에도 불구하고 기계 생물학 연구에서 초파리 및 기타 다세포 모델 유기체를 사용하는 것은 실험 도구의 문제로 인해 방해를 받았습니다. 다양한 자극을 준비, 분류, 이미징 또는 적용하기위한 기존의 기술은 대부분 수동 조작이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 전문 지식이 필요하며 변동성을 도입하고 실험 설계 및 표본 크기를 제한합니다11. 최근의 마이크로 기술 발전은 매우 높은 처리량과 고도로 제어 된 실험 매개 변수12,13,14로 새로운 생물학적 분석을 가능하게하는 훌륭한 리소스입니다.
이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 단축 압축 형태로 기계적 자극을 정렬, 고정 및 정확하게 적용하기 위한 향상된 미세유체 장치의 개발에 대해 설명합니다15(그림 1). 미세 유체 시스템과 유리 커버 슬립의 통합은 자극 동안 샘플의 고해상도 컨포칼 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 -omics 분석을 실행하기 위한 자극 후 배아의 빠른 수집을 가능하게 했습니다(그림 2). 이 장치의 설계 고려 사항에 대한 설명과 소프트 리소그래피 및 실험 특성화를 사용한 제조가 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 장치의 실리콘 웨이퍼 몰드를 만들려면 높은 종횡비 (AR) 트렌치 (AR >5)가있는 넓은 영역에 두꺼운 포토 레지스트 (두께 >200μm)를 균일하게 코팅해야하기 때문에이 방법은 기존의 포토 리소그래피 금형 제작 프로토콜을 상당히 수정했습니다. 이러한 방식으로, 이 방법은 포토레지스트의 취급, 접착, 코팅, 패터닝 및 개발을 용이하게 하였다. 또한 잠재적 인 함정과 그 해결책에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 설계 및 제조 전략의 다양성은 초파리 난실 및 뇌 오가노이드16과 같은 다른 다세포 시스템을 사용하여 입증되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 기계적 자극을 자동으로 정렬, 고정 및 정확하게 적용하는 미세 유체 장치의 개발에 대해 설명합니다. 미세 유체 시스템과 얇은 유리 커버 슬립의 통합은 자극 중에 고해상도 컨포칼 현미경으로 배아의 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 다운스트림 생물학적 분석을 실행하기 위한 자극 직후 배아의 수집을 가능하게 했습니다. 이 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 과학 재단 (CMMI-1946456), 공군 과학 연구실 (FA9550-18-1-0262) 및 국립 보건원 (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
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