ハイスループットマイクロ流体圧縮システムによる多細胞生物のメカノ刺激
Summary
本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。
Abstract
胚形成中、協調的な細胞運動は、遺伝子発現および活性を調節する機械的な力を生成する。このプロセスを研究するために、吸引やカバーガラス圧縮などのツールを使用して、胚全体を機械的に刺激してきました。これらのアプローチは、不正確であり、手動処理を必要とし、同時に数個の胚しか処理できないため、実験計画を制限します。マイクロ流体システムは、スループットと精度を向上させながら、このような実験タスクを自動化する大きな可能性を秘めています。この記事では、ショウジョウバエ メラノガスター(ショウジョウバエ )胚全体を正確に圧縮するために開発されたマイクロ流体システムについて説明します。このシステムは、空気圧で作動する変形可能な側壁を備えたマイクロチャネルを備えており、胚の整列、固定化、圧縮、および刺激後の収集を可能にします。これらのマイクロチャネルを7つのレーンに並列化することにより、安定したまたは動的な圧縮パターンを数百の ショウジョウバエ 胚に同時に適用できます。このシステムをガラスカバーガラス上に製造することで、高解像度顕微鏡によるサンプルの機械的刺激とイメージングを同時に行うことができます。さらに、PDMSのような生体適合性材料の利用と、システム内を流体を流す能力により、このデバイスは媒体依存サンプルを用いた長期実験が可能です。このアプローチにより、サンプルに機械的にストレスを与える手動取り付けの必要性もなくなります。さらに、マイクロチャネルからサンプルを迅速に収集できるため、従来の機械的刺激アプローチでは達成できない大量のサンプルを必要とするオミクスアッセイを含む、刺激後の分析が可能になります。このシステムの形状は、異なる生物学的システムに対して容易に拡張可能であり、多数の分野が、高いサンプルスループット、機械的刺激または固定化、および自動アライメントを含む本明細書に記載される機能的特徴から利益を得ることを可能にする。
Introduction
生命システムは、その生涯を通じて常にさまざまな機械的入力を経験し、応答します1。メカノトランスダクションは、発達障害、筋肉や骨の喪失、機械的環境によって直接的または間接的に影響を受けるシグナル伝達経路を介した神経病理学など、多くの疾患に関連しています2。しかし、機械受容性シグナル伝達経路4における機械的刺激3によって制御される遺伝子やタンパク質はほとんど分かっておらず5、機械的制御機構の解明や病的メカノトランスダクションに関連する疾患の分子標的の同定は進んでいません6,7。.メカノバイオロジー研究を関連する生理学的プロセスに投影する際の制限要因の1つは、無傷の多細胞生物の代わりに、従来の培養皿で個々の細胞を使用することです。ショウジョウバエ(ショウジョウバエ)などのモデル生物は、動物の発生に関与する遺伝子、シグナル伝達経路、およびタンパク質の理解に大きく貢献しています8,9,10。しかし、ショウジョウバエなどの多細胞モデル生物をメカノバイオロジー研究に利用することは、実験ツールの課題によって妨げられてきました。様々な刺激を準備、ソート、イメージング、または適用するための従来の技術は、ほとんどが手動操作を必要とする。これらのアプローチは時間がかかり、専門知識を必要とし、ばらつきをもたらし、実験計画とサンプルサイズを制限します11。最近のマイクロテクノロジーの進歩は、非常に高いスループットと高度に制御された実験パラメータを備えた新しい生物学的アッセイを可能にするための優れたリソースです12、13、14。
本稿では、ショ ウジョウバエ の数百個の胚全体に一軸圧縮の形で機械的刺激を整列させ、固定し、正確に適用するための強化されたマイクロ流体デバイスの開発について説明します15(図1)。マイクロ流体システムとガラスカバーガラスの統合により、刺激中のサンプルの高解像度共焦点イメージングが可能になりました。また、マイクロ流体デバイスは、オミクスアッセイを実行するための刺激後の胚の迅速な収集を可能にしました(図2)。このデバイスの設計上の考慮事項の説明、ならびにソフトリソグラフィおよび実験的特性評価を使用した製造を本明細書に記載する。このようなデバイスのシリコンウェーハモールドを製造するには、高アスペクト比(AR)トレンチ(AR >5)を備えた大面積にわたって厚いフォトレジスト(厚さ>200μm)を均一にコーティングする必要があるため、この方法は従来のフォトリソグラフィモールド製造プロトコルを大幅に変更しました。このようにして、この方法は、フォトレジストの取り扱い、接着、コーティング、パターニング、および現像を容易にした。さらに、潜在的な落とし穴とその解決策についても説明します。最後に、この設計および製造戦略の多様性は、 ショウジョウバエ 卵室や脳オルガノイドなどの他の多細胞システムを使用して実証されました16。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、何百もの ショウジョウバエ 胚全体に機械的刺激を自動的に整列させ、固定し、正確に適用するマイクロ流体デバイスの開発について説明しています。マイクロ流体システムと薄いガラスカバーガラスの統合により、刺激中に高解像度の共焦点顕微鏡で胚をイメージングすることができました。マイクロ流体デバイスは、下流の生物学的アッセイを実行するための刺激?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団(CMMI-1946456)、空軍科学研究局(FA9550-18-1-0262)、および国立衛生研究所(R01AG06100501A1;R21AR08105201A1)。
Materials
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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