Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Charakterisierung eines mikrofluidischen Systems, das in der Lage ist, Hunderte von Drosophila melanogaster-Embryonen mit minimalem Benutzereingriff auszurichten, zu immobilisieren und präzise zu komprimieren. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung und Rückgewinnung von Proben für die Analyse nach der Stimulation und kann skaliert werden, um andere mehrzellige biologische Systeme aufzunehmen.
Abstract
Während der Embryogenese erzeugt die koordinierte Zellbewegung mechanische Kräfte, die die Genexpression und -aktivität regulieren. Um diesen Prozess zu untersuchen, wurden Werkzeuge wie Aspiration oder Deckglaskompression verwendet, um ganze Embryonen mechanisch zu stimulieren. Diese Ansätze schränken das experimentelle Design ein, da sie ungenau sind, manuelle Handhabung erfordern und nur ein paar Embryonen gleichzeitig verarbeiten können. Mikrofluidische Systeme haben großes Potenzial, solche experimentellen Aufgaben zu automatisieren und gleichzeitig den Durchsatz und die Präzision zu erhöhen. Dieser Artikel beschreibt ein mikrofluidisches System, das entwickelt wurde, um ganze Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen) Embryonen präzise zu komprimieren. Dieses System verfügt über Mikrokanäle mit pneumatisch betätigten verformbaren Seitenwänden und ermöglicht die Ausrichtung des Embryos, die Immobilisierung, die Kompression und die Entnahme nach der Stimulation. Durch die Parallelisierung dieser Mikrokanäle in sieben Bahnen können stetige oder dynamische Kompressionsmuster auf Hunderte von Drosophila-Embryonen gleichzeitig angewendet werden. Die Herstellung dieses Systems auf einem Glasdeckglas ermöglicht die gleichzeitige mechanische Stimulation und Bildgebung von Proben mit hochauflösenden Mikroskopen. Darüber hinaus ermöglichen die Verwendung biokompatibler Materialien wie PDMS und die Fähigkeit, Flüssigkeit durch das System zu fließen, Langzeitexperimente mit medienabhängigen Proben. Dieser Ansatz eliminiert auch die Notwendigkeit einer manuellen Montage, die die Proben mechanisch belastet. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, schnell Proben aus den Mikrokanälen zu entnehmen, Post-Stimulationsanalysen, einschließlich -omics-Assays, die große Probenzahlen erfordern, die mit herkömmlichen mechanischen Stimulationsansätzen nicht erreichbar sind. Die Geometrie dieses Systems ist leicht auf verschiedene biologische Systeme skalierbar, so dass zahlreiche Felder von den hier beschriebenen funktionellen Merkmalen profitieren können, einschließlich eines hohen Probendurchsatzes, mechanischer Stimulation oder Immobilisierung und automatisierter Ausrichtung.
Introduction
Lebende Systeme erleben und reagieren während ihrer gesamten Lebensdauer ständig auf verschiedene mechanische Eingaben1. Mechanotransduktion wurde mit vielen Krankheiten in Verbindung gebracht, einschließlich Entwicklungsstörungen, Muskel- und Knochenschwund und Neuropathologien durch Signalwege, die direkt oder indirekt von der mechanischen Umgebung beeinflusst werden2. Die Gene und Proteine, die durch mechanische Stimulation3 in den mechanosensitiven Signalwegen4 reguliert werden, bleiben jedoch weitgehend unbekannt5, was die Aufklärung der mechanischen Regulationsmechanismen und die Identifizierung molekularer Ziele für Erkrankungen im Zusammenhang mit pathologischer Mechanotransduktion verhindert 6,7 . Ein limitierender Faktor bei der Projektion mechanobiologischer Studien auf die damit verbundenen physiologischen Prozesse ist die Verwendung einzelner Zellen mit herkömmlichen Kulturschalen anstelle intakter mehrzelliger Organismen. Modellorganismen wie Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) haben wesentlich zum Verständnis der Gene, Signalwege und Proteine beigetragen, die an der Tierentwicklung beteiligt sind 8,9,10. Dennoch wurde die Verwendung von Drosophila und anderen mehrzelligen Modellorganismen in der mechanologischen Forschung durch Herausforderungen mit experimentellen Werkzeugen behindert. Konventionelle Techniken zur Vorbereitung, Sortierung, Bildgebung oder Anwendung verschiedener Reize erfordern meist manuelle Manipulation; Diese Ansätze sind zeitaufwendig, erfordern Fachwissen, führen zu Variabilität und begrenzen das experimentelle Design und die Stichprobengröße11. Jüngste mikrotechnologische Fortschritte sind eine großartige Ressource, um neuartige biologische Assays mit sehr hohem Durchsatz und streng kontrollierten experimentellen Parameternzu ermöglichen 12,13,14.
Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung eines verbesserten mikrofluidischen Geräts zur Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen Anwendung mechanischer Stimulation in Form von uniaxialer Kompression auf Hunderte von ganzen Drosophila-Embryonen 15 (Abbildung 1). Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem Glasdeckglas ermöglichte eine hochauflösende konfokale Bildgebung der Proben während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch eine schnelle Entnahme der Embryonen nach der Stimulation für laufende -omics-Assays (Abbildung 2). Erläuterungen zu den Designüberlegungen dieser Vorrichtung sowie zur Herstellung unter Verwendung von Softlithographie und experimenteller Charakterisierung werden hierin beschrieben. Da die Herstellung einer Siliziumwaferform aus einer solchen Vorrichtung eine gleichmäßige Beschichtung von dickem Fotolack (Dicke >200 μm) über große Flächen mit Gräben mit hohem Aspektverhältnis (AR >5) erfordert, modifizierte diese Methode das traditionelle photolithografische Formherstellungsprotokoll erheblich. Auf diese Weise erleichterte dieses Verfahren die Handhabung, Haftung, Beschichtung, Strukturierung und Entwicklung des Fotolacks. Darüber hinaus werden mögliche Fallstricke und deren Lösungen diskutiert. Schließlich wurde die Vielseitigkeit dieser Design- und Herstellungsstrategie anhand anderer mehrzelliger Systeme wie Drosophila-Eikammern und Gehirnorganoiden demonstriert16.
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Protocol
1. Vorbereitung der Siliziumwaferform
- Reinigen Sie den Siliziumwafer (siehe Materialtabelle) zuerst mit Aceton und dann mit Isopropylalkohol (IPA).
- Legen Sie den Siliziumwafer für 30 Minuten auf eine 250 °C heiße Heizplatte, um ihn zu dehydrieren (Abbildung 3A).
- Beschichten Sie den Siliziumwafer mit Hexamethyldisilazan (HDMS) in einem Vapor-Prime-Ofen (siehe Materialtabelle) (Prozesstemperatur: 150 °C, Prozessdruck: 2 Torr, Prozesszeit: 5 min, HDMS-Volumen: 5 μL) (Abbildung 3B).
- Eine Flasche SU-8 2100 Fotolack (siehe Materialtabelle) für 15 min in einen 60 °C heißen Ofen stellen, um die Viskosität zu reduzieren.
HINWEIS: Beim Erhitzen im Ofen nimmt die Viskosität des Fotolacks ab. Fotolacke mit gesenkter Viskosität können einfacher gehandhabt und genauer auf den Wafer gegossen werden. - Legen Sie den Siliziumwafer auf eine 60 °C heiße Heizplatte und gießen Sie 1 ml des erhitzten Fotolacks für jeden Zoll des Wafers, bis der Fotolack den größten Teil der Oberfläche bedeckt (Abbildung 3C).
- Übertragen Sie den photolackbeschichteten Siliziumwafer auf einen Spin-Coater (siehe Materialtabelle).
- Wenden Sie den Pre-Spin zuerst bei 250 U/min für 30 s und dann bei 350 U/min für weitere 30 s an, beide mit 100 U/min Beschleunigung (Abbildung 3D).
- Entfernen Sie den überschüssigen Fotolack von den Rändern des Siliziumwafers mit einem Reinraumtupfer.
- Wenden Sie einen Spin zuerst bei 500 U/min für 15 s mit 100 U/min Beschleunigung und dann bei 1450 U/min für 30 s mit 300 U/min Beschleunigung an (Abbildung 3E).
- Entfernen Sie die Randwulst mit einem Reinraumtupfer.
- Platzieren Sie den Siliziumwafer auf einer 50 °C heißen Heizplatte und sprühen Sie Aceton auf den Wafer, um Unvollkommenheiten zu entfernen und eine gleichmäßige Beschichtung zu fördern (Abbildung 3F).
- Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte langsam auf 95 °C mit einer Rate von 2 °C / min.
- Weichbacken Sie den Siliziumwafer bei 95 °C für 50 min (Abbildung 3G).
- Kühlen Sie die Heizplatte langsam auf Raumtemperatur mit einer Rate von 2°C/min ab.
- Legen Sie den Siliziumwafer auf einen Masken-Aligner (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Fotomaske darauf (siehe ergänzende Abbildung 1 für die Photomaskengeometrie).
- Besetzen Sie den Siliziumwafer 350 mJ/cm 2 UV-Licht (35 mW/cm2 für 10 s) durch die Fotomaske mit dem Kontaktmasken-Aligner aus (Abbildung 3H).
- Tragen Sie aufeinanderfolgende Nachbelichtungsbacken auf den Siliziumwafer auf, indem Sie den Wafer für 5 min bei 50 °C, weitere 5 Minuten bei 65 °C und schließlich weitere 20 min bei 80 °C auf eine Heizplatte legen (Abbildung 3I).
- Kühlen Sie den Siliziumwafer langsam auf Raumtemperatur mit einer Rate von 2 °C/min ab.
- Legen Sie einen Magnetrührer mit einem etwas kleineren Durchmesser als der Siliziumwafer in ein Becherglas. Drehen Sie den Siliziumwafer auf den Kopf und legen Sie ihn auf das Becherglas.
- Stellen Sie das Becherglas in ein anderes größeres Becherglas und füllen Sie das größere Becherglas mit einer frischen Entwicklerlösung (siehe Materialtabelle). Lassen Sie den Siliziumwafer 30 Minuten bei eingeschaltetem Rührer in den Behälter eintauchen (Abbildung 3J).
- Übertragen Sie den Siliziumwafer für 1 h bei 40 kHz in einen Ultraschallbadsonikator, der mit dem frischen Entwickler gefüllt ist (Abbildung 3K).
- Waschen Sie den Siliziumwafer gründlich mit einer IPA-Lösung, um die endgültige Siliziumwaferform zu erhalten (Abbildung 3L).
2. Herstellung des mikrofluidischen Chips
- Legen Sie die Siliziumwaferform zusammen mit 10 Tropfen (~ 500 μL) Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan (PFOCTS, siehe Materialtabelle) in ein kleines Wiegeboot in der Nähe.
- Schließen Sie den Exsikkator für 30 Minuten an eine Vakuumpumpe bei ca. 200 Torr an.
- Schalten Sie das Exsikkatorventil aus und trennen Sie die Vakuumpumpe über Nacht für die PFOCTS-Beschichtung.
- Die vorvernetzte Lösung aus Polydimethylsiloxan (PDMS) wird hergestellt, indem die PDMS-Base mit dem Härter (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 10:1 gemischt wird.
- Entgasen Sie das Gemisch, indem Sie es in eine Zentrifuge geben (500 x g für 5 min bei Raumtemperatur).
HINWEIS: Durch diese Zentrifugation können Blasen auf die Oberseite wandern und somit in kurzer Zeit entfernt werden. - Gießen Sie die entgaste PDMS-Lösung auf die Siliziumwaferform.
- Entgasen Sie es erneut, um die auf der Formoberfläche eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen.
- Das PDMS wird in einem 60-°C-Ofen für 1 h und 50 min ausgehärtet (Abbildung 3M).
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die Ränder des ausgehärteten PDMS-Bereichs entsprechend der mikrofluidischen Chipgeometrie zu schneiden (Abbildung 3N).
- Schälen Sie das PDMS-Teil und legen Sie es kopfüber auf eine Schneidematte.
- Schneiden Sie das PDMS-Teil mit einem Rasiermesser in seine endgültige Form (Abbildung 3O).
- Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher am PDMS mit einem Biopsiestempel (siehe Materialtabelle) oder einer Nadel mit stumpfer Spitze (Abbildung 3P).
- Verwenden Sie für das Einlassloch des Embryos einen Stempel mit einem Durchmesser von 4 mm.
- Verwenden Sie für die Auslasslöcher des Embryos einen Stempel mit einem Durchmesser von 1,3 mm.
- Verwenden Sie für die Gaseinlassöffnung einen 2-mm-Stempel.
- Verwenden Sie ein Stück Klebeband, um Partikel zu entfernen, die auf der gemusterten Oberfläche des PDMS verbleiben könnten.
- Reinigen Sie einen 24 mm x 60 mm großen rechteckigen Glasobjektträger zuerst mit Aceton und dann mit IPA.
- Trocknen Sie die Glasoberfläche mit einer Luftpistole, die an eine gefilterte Luftquelle angeschlossen ist.
- Tragen Sie einen Dehydrierungsbacken auf den Objektträger auf, indem Sie ihn 2 h lang auf eine 250 °C heiße Heizplatte legen (Abbildung 3Q).
- Decken Sie den Objektträger mit einem Becherglas ab, um eine Oberflächenkontamination zu vermeiden.
- Legen Sie das PDMS mit der gemusterten Seite nach oben und den dehydrierten Glasobjektträger in einen Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).
- Behandeln Sie das PDMS und den Objektträger 30 s lang mit Sauerstoffplasma bei 18 W.
- Platzieren Sie das PDMS auf dem Objektträger, dessen gemusterte Oberfläche dem Objektträger zugewandt ist, um die Mikrokanäle durch kovalente Bindung abzudichten (Abbildung 3R).
- Verwenden Sie eine Pinzette, um das PDMS-Teil vorsichtig gegen den Glasobjektträger zu drücken, um einen vollständigen Konformationskontakt zu gewährleisten.
- Lagern Sie den fertigen mikrofluidischen Chip über Nacht bei Raumtemperatur, damit die Verklebung ihre endgültige Festigkeit erreichen kann.
3. Vorbereitung der Fruchtfliegenembryonen
- Lassen Sie erwachsene Oregon-R-Fliegen Eier auf Apfelsaft-Agarplatten legen (1,5% Agar, 25% Apfelsaft, 2,5% Saccharose) und sammeln Sie die Platten zur gewünschten Entwicklungszeit nach der Eiablage für das gegebene Experiment.
HINWEIS: Für die vorliegenden Experimente wurden die Platten nach 140 min gesammelt, um Embryonen im Zellular Stadium17 vorzubereiten und zu sortieren. - Überfluten Sie den Agar mit Embryo-Eiwäsche (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) und rühren Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel, um sie vom Agar zu entfernen.
- Die Embryonen werden unter gelegentlichem Rühren für 90 s in eine 50%ige Bleichlösung überführt. Die Embryonen durch ein Gewebesieb abseihen und die Bleichlösung gründlich mit Wasser abwaschen.
- Übertragen Sie die Embryonen in eine 90 mm Glas-Petrischale mit genügend Embryo-Eiwäsche, um die Embryonen vollständig zu bedecken.
- Untersuchen Sie die Embryonen mit Transillumination auf einem Seziermikroskop und wählen Sie Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums für die Beladung in das mikrofluidische Gerät aus.
HINWEIS: In dieser Anwendung wurden Embryonen im Zellularisierungsstadium ausgewählt. Die detaillierten Beschreibungen, wie die richtige Auswahl des Entwicklungsstadiums sichergestellt werden kann, finden Sie im Laborhandbuch für Drosophila17.
4. Anwendung mechanischer Stimulation auf Fruchtfliegenembryonen mit dem mikrofluidischen Chip
- Grundierung aller sieben embryonalen Mikrokanäle, indem sie mit 0,4 μm gefiltertem IPA durch den Haupteinlass des Embryos gefüllt werden.
- Ersetzen Sie IPA durch 0,4 μm gefiltertes entionisiertes (DI) Wasser.
- Ersetzen Sie das DI-Wasser durch eine Eiwaschlösung für den Embryo.
- Sammeln Sie etwa 100 vorausgewählte Embryonen aus der Glaspetrischale mit einer Glaspipette.
- Pipettieren Sie die Embryonen in die Eingangsöffnung des Embryos (Abbildung 4A).
- Anlegen Sie einen Unterdruck von etwa 3 PSI (d. H. Vakuum) an den Gaseinlass mit einer tragbaren Vakuumpumpe, um die Mikrokanäle des Embryos zu öffnen.
- Neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach unten, damit sich die Embryonen automatisch ausrichten und in den Mikrokanälen des Embryos absetzen (Abbildung 4B).
- Wenn die Mikrokanaleingänge des Embryos durch mehrere gleichzeitig eintretende Embryonen verstopft werden, neigen Sie den mikrofluidischen Chip nach oben und dann wieder nach unten, um die Verstopfung zu beseitigen.
- Basierend auf dem erforderlichen Durchsatz werden bis zu 300 Embryonen in die Mikrokanäle des Embryos eingeführt.
- Sobald die Embryonenbeladung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Vakuum, um die Embryonen zu immobilisieren.
- Neigen Sie den mikrofluidischen Chip zurück in die horizontale Position (Abbildung 4C).
- Schließen Sie eine tragbare Überdruckquelle (siehe Materialtabelle) mit einem Manometer an den Gaseinlass an, um eine 3-PSI-Kompression anzuwenden (Abbildung 4D).
- Überprüfen Sie kontinuierlich das Manometer, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Kompressionsniveau angewendet wird.
- Wenn Live-Bildgebungsexperimente an den mechanisch stimulierten Embryonen durchgeführt werden, platzieren Sie den mikrofluidischen Chip auf einem Standard-Glasobjektträgerhalter auf dem Mikroskoptisch, wobei der Gaseinlass mit der Druckquelle verbunden ist.
- Sobald das Kompressionsexperiment abgeschlossen ist, können die Embryonen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden. Um dies zu tun, wenden Sie zunächst das Vakuum an den Gaseinlass an, um die Embryonen zu befreien.
- Neigen Sie dann den mikrofluidischen Chip nach oben, damit sich die Embryonen in Richtung des Embryo-Einführungsports bewegen können (Abbildung 4E).
- Sammeln Sie die Embryonen aus dem mikrofluidischen Chip mit einer Glaspipette.
HINWEIS: Nach der Entnahme können die Auswirkungen der Kompression auf die embryonale Entwicklung und Lebensfähigkeit untersucht werden, indem die Fruchtfliegen bis ins Erwachsenenalter gezüchtet werden. Die Hochdurchsatz-Verarbeitungskapazität des mikrofluidischen Geräts ermöglicht auch die Verwendung von Embryonen in nachgeschalteten Omics-basierten Assays, die eine große Anzahl von Proben erfordern (Abbildung 2).
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Representative Results
Das mikrofluidische System ist in zwei Teilkompartimente unterteilt, die durch verformbare PDMS-Seitenwände getrennt sind. Das erste Kompartiment ist das Flüssigkeitssystem, in das Drosophila-Embryonen eingeführt, automatisch ausgerichtet, aufgereiht und komprimiert werden. Das zweite Kompartiment ist ein Gassystem, bei dem der Gasdruck auf beiden Seiten der Kompressionskanäle über Dead-End-Mikrokanäle gesteuert wird, um die effektive Breite der Kompressionskanäle präzise zu steuern. Das mikrofluidische Gerät ist unten mit einem Glasobjektträger versiegelt, der eine hochauflösende Live-Abbildung der Proben (ergänzende Abbildung 2) für die relevanten Abmessungen des mikrofluidischen Geräts ermöglicht.
Mehrzellige Organismen wie Drosophila-Embryonen werden im gewünschten embryonalen Entwicklungsstadium selektiert. Bei den Drosophila-Embryonen sind alle Entwicklungsstadien gleichermaßen mit diesem Ansatz kompatibel, da sich die Größe der Embryonen erst ändert, wenn sie schlüpfen. Ausgewählte Proben werden durch den großen Einlass (d. h. 4 mm Durchmesser) mit einer Glasmikropipette in das mikrofluidische Gerät eingeführt. Das Gerät wird dann nach unten geneigt, damit die Embryonen in die sieben parallel organisierten Kompressionskanäle fließen können. Der sich verengende Vorhof, der den Embryoneneinlass mit dem Kompressionskanal verbindet, sorgt für eine automatische Ausrichtung der Embryonen, bevor sie den Eingang der Kompressionskanäle erreichen. Das Vakuum, das auf den Gaseinlass angelegt wird, lenkt die verformbaren Seitenwände nach außen ab, wodurch die effektive Mikrokanalbreite erhöht wird und die Embryonen nacheinander in die Kompressionskanäle eintreten können. Die sieben Kompressionskanäle sind 22 mm lang und können parallel bis zu 300 Drosophila-Embryonen in einem Durchgang aufnehmen. Kompressionskanäle enden in einem Engpass, bei dem die Breite des Mikrokanals auf ein Niveau abnimmt, das viel kleiner ist als das der Proben, wodurch Flüssigkeit durchfließen kann, während die Embryonen zurückgehalten werden. Durch diesen Ansatz werden die Embryonen innerhalb der Kompressionskanäle konzentriert. Nach dem Einbringen der Embryonen wird das Vakuum im Gaseinlass entfernt, und die Mikrokanal-Seitenwände kehren in ihre ursprüngliche Position zurück und immobilisieren die aufgereihten Embryonen von beiden Seiten. Die Kompression kann durch Anlegen von Überdruck auf den Gaseinlass erreicht werden, der die verformbaren Seitenwände nach innen ablenkt und die effektive Mikrokanalbreite reduziert. Die Menge der Kompression, die auf Embryonen angewendet wird, kann genau reguliert werden, indem die Mikrokanalabmessungen, die Dicke der verformbaren Seitenwände, der Elastizitätsmodul des PDMS und der ausgeübte Druck angepasst werden. Nach dem Kompressionsexperiment können die Embryonen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden, indem ein Vakuum an den Gaseinlass angelegt und das mikrofluidische Gerät in eine andere Richtung gekippt wird.
Diese mikrofluidische Vorrichtung wurde unter Verwendung der Softlithographie18 hergestellt. Die Herstellung dicker Strukturen mit Merkmalen mit hohem Aspektverhältnis unter Verwendung von ultradickem Fotolack erfordert jedoch erhebliche Abweichungen von den für die Standardfertigung definierten Protokollen (Abbildung 3). Zusammen mit der Hexamethyldisilazan (HDMS) -Beschichtung wurden die Siliziumwafer vor der Schleuderbeschichtung gereinigt, um organische Rückstände zu entfernen, und eingebrannt, um Oberflächenfeuchtigkeit zu entfernen. Diese zusätzlichen Schritte verbesserten die Bindung der dicken Fotolackschicht an den Siliziumwafer. Der Fotolack wurde ebenfalls vor dem Gießen erhitzt, um die Viskosität zu verringern, was für die Abdeckung der gesamten Waferoberfläche entscheidend war. Die angestrebte Fotolackschichtdicke wurde durch drei Spinnschritte erreicht, wobei jeder Spinnschritt überschüssigen Fotolack allmählich entfernte, ohne die Waferoberfläche zu kontaminieren. Inspiriert von zuvor veröffentlichten Methoden19 wurde Aceton, eines der Lösungsmittel des Fotolacks, auf den Siliziumwafer gesprüht, um Fotolackfehler zu beseitigen und die Gleichmäßigkeit der Beschichtung zu erhöhen. Während der aufeinanderfolgenden Backschritte wurde die Temperatur langsam verändert, um die thermische Belastung zu minimieren, was zur Delaminierung des Fotolacks aus dem Siliziumwafer führen konnte. Aufgrund ähnlicher Bedenken wurde die Backtemperatur gesenkt und gleichzeitig die Dauer erhöht. Einer der schwierigsten Schritte bei der photolithografischen Herstellung von Gräben mit hohem Aspektverhältnis war die Entfernung des nicht ausgehärteten Fotolacks nach UV-Belichtung. Um das Eindringen der Entwicklerlösung in die Gräben zu maximieren, wurde der Siliziumwafer auf den Kopf gestellt und kontinuierlich mit einem Rührer mit der Entwicklerlösung vermischt. Auf diese Weise könnte die neue Entwicklerlösung mit dem nicht ausgehärteten Fotolack reagieren und ihn entfernen. Diesem Schritt folgte ein Ultraschallbad, bei dem der restliche Fotolack entfernt wurde. Nachdem die Siliziumwaferform erfolgreich erzeugt worden war, bestand das Standard-Replikatformverfahren aus Mischen, Entgasen, Gießen, Aushärten, Schälen, Stanzen und Plasmabonding für die Herstellung der endgültigen mikrofluidischen Vorrichtung20.
Die Funktionalität des mikrofluidischen Geräts wurde experimentell bestimmt, indem Drosophila-Embryonen in die Kompressionskanäle geladen und Überdruck auf die Gaskanäle ausgeübt wurden. Messungen der abnehmenden Breite der Embryonen unter dem Mikroskop (Abbildung 5A) zeigen, wie der Gasdruck verwendet werden kann, um ein Zielkompressionsniveau zu erhalten (Abbildung 5B). Zeitrafferaufnahmen von ausgerichteten Embryonen, die sich einer Kompression unterziehen, zeigen auch die Kompatibilität dieses Systems mit der konfokalen Mikroskopie.
Abbildung 1: Aufbau und Funktion des mikrofluidischen Geräts. Das mikrofluidische Gerät besteht aus sieben parallelen Kompressionsmikrokanälen, die bis zu 300 ganze Drosophila-Embryonen gleichzeitig testen können. (A) Die Embryonen wurden über den Haupteinlass des Embryos in das Gerät eingeführt und beim Eintritt in die Mikrokanäle automatisch entlang der hinter-vorderen Achse ausgerichtet. (B) Die Embryonen bewegten sich frei, wenn Unterdruck durch den Gaseinlass angelegt wurde, da dieser die verformbaren Mikrokanal-Seitenwände nach außen ablenkte. Dies ermöglichte sowohl das Be- als auch das Entladen auf einer einzigen Spur. Wenn der Unterdruck entfernt wurde, wurden die Embryonen in den Mikrokanälen immobilisiert. Wenn Überdruck angelegt wurde, komprimierten die Mikrokanal-Seitenwände die Embryonen durch Ablenkung nach innen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Prozessablauf von mikrofluidischen Kompressionsexperimenten für mechanobiologische Studien. (A) Das mikrofluidische Hochdurchsatz-Mechanostimulationsgerät besteht aus PDMS und einem Glasobjektträger, um Hunderte von mehrzelligen biologischen Proben zu verarbeiten. (B) Das Gerät ist auf die Arbeit mit verschiedenen mehrzelligen Systemen wie Drosophila-Eikammern, Drosophila-Embryonen oder Gehirnorganoiden zugeschnitten. Dieses Gerät kann stetige oder dynamische Kompressionsmuster auf die Biosysteme anwenden. (C) Die Systeme können mit einem konfokalen Mikroskop im Laufe der Zeit abgebildet werden, während sie komprimiert werden. Die Expressionsniveaus und die Lokalisation von fluoreszenzmarkierten Proteinen als Reaktion auf Kompression können analysiert werden. Nach der Entnahme können die Systeme für Post-Stimulationstests und Bildgebung analysiert werden. Die Hochdurchsatz-Verarbeitungskapazität des mikrofluidischen Geräts ermöglicht es auch, die Systeme zu lysieren und in Omics-basierten biologischen Assays zu verwenden, die eine große Anzahl von Proben erfordern, wie in der Abbildung mit einem 2-dimensionalen differentiellen Gelelektrophorese-Bildbeispiel gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Herstellungsprozess der Siliziumwaferform mit dickem Fotolack und Gräben mit hohem Aspektverhältnis. (A,B) Der gesamte Herstellungsprozess begann mit der Vorbereitung des Siliziumwafers für die Fotolackbeschichtung. (C-G) Eine dicke Fotolackbeschichtung wurde gleichmäßig auf den Siliziumwafer aufgetragen. (H,I) Der Fotolack wurde mit UV-Belichtung durch die Fotomaske strukturiert. (J-L) Unausgehärteter Fotolack wurde aus dem Siliziumwafer entfernt. (M-P) Das PDMS-Teil wurde durch Softlithographie hergestellt. (Q,R) Das Gerät wurde mit dem Glasobjektträger versiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Funktionsweise des mikrofluidischen Geräts . (A) Zuerst wurden die Embryonen in den Haupteinlass des Embryos pipettiert. (B) Zweitens wurde Unterdruck auf den Gaseinlass ausgeübt und die mikrofluidische Vorrichtung nach unten geneigt, damit sich die Embryonen ausrichten und in die Mikrokanäle laden konnten. (C) Drittens wurde Unterdruck entfernt, um die Embryonen zu immobilisieren. (D) Viertens wurde Überdruck auf die Gaskanäle ausgeübt, um die Embryonen zu komprimieren. (E) Schließlich wurden die Embryonen aus dem mikrofluidischen Gerät entnommen, indem das mikrofluidische Gerät wieder auf Unterdruck umgeschaltet und das mikrofluidische Gerät nach oben geneigt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Experimentelle Messung des Kompressionsgrades des Embryos . (A) Repräsentative Embryonen innerhalb des mikrofluidischen Geräts unter verschiedenen Gasdruckniveaus. Während die Embryonen unter Vakuum oder in neuronalen Druckzuständen keine signifikante Kompression erfahren, werden sie komprimiert, wenn Überdruck angelegt wird. (B) Die Menge der einachsigen Druckspannung, die auf die Embryonen bei unterschiedlichen Gasdruckniveaus angewendet wird (Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Kompression von Gehirnorganoiden in einem mikrofluidischen Gerät, das nach derselben Strategie entwickelt und hergestellt wurde. (A) Die Kompression der Hirnorganoide mit zunehmendem Niveau, wenn der Gasdruck erhöht wird. (B) Die Breite der Gehirnorganoide innerhalb der Mikrokanäle bei unterschiedlichen Druckstufen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Draufsicht auf die Photomaske, die bei der photolithografischen Herstellung der Siliziumwaferform verwendet wird. Es gibt fünf identische mikrofluidische Gerätegeometrien, die sich innerhalb des Durchmesserbereichs von 4 Zoll befinden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Draufsicht auf das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät mit den relevanten Abmessungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der Artikel beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Geräts zur automatischen Ausrichtung, Immobilisierung und präzisen mechanischen Stimulation von Hunderten von ganzen Drosophila-Embryonen . Die Integration des mikrofluidischen Systems mit einem dünnen Glasdeckglas ermöglichte die Bildgebung von Embryonen mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie während der Stimulation. Das mikrofluidische Gerät ermöglichte auch die Entnahme der Embryonen direkt nach der Stimulation für nachgeschaltete biologische Assays. Die Designüberlegungen, die Herstellungsmethode und die Charakterisierung dieses Geräts wurden ausführlich beschrieben. Das Herstellungsprotokoll für Siliziumwaferformen ermöglichte die gleichmäßige dicke Beschichtung des Fotolacks mit Gräben mit hohem Aspektverhältnis.
Für den Erfolg dieses Herstellungsansatzes ist es wichtig, die Temperatur der Backschritte zu senken und die Heiz- und Abkühlraten des Siliziumwafers nach der Beschichtung mit Fotolack zu minimieren. Wenn dies nicht richtig gemacht wird, kann die Fotolackbeschichtung leicht delaminieren und die Formgeometrie verändern. Sobald die Siliziumwaferform erfolgreich hergestellt ist, kann sie in haltbarere Materialien kopiert werden, um eine Beschädigung der ursprünglichen Form während aufeinanderfolgender PDMS-Replikat-Formschritte zu vermeiden, die auch Heiz- und Kühlzyklen enthalten21. Die Herstellung des PDMS-Mikrofluidikgeräts durch Replikatspritzguss beruht auf dem erfolgreichen Ablösen von Seitenwandstrukturen mit hohem Aspektverhältnis aus der Form. Damit dieser Herstellungsschritt zuverlässig ist, ist es wichtig, die Oberfläche des Siliziumwafers ordnungsgemäß mit einem Silanisierungsmittel zu beschichten, um das Abschälen zu erleichtern. Die Beschichtung sollte auch nach der Herstellung von ca. 20 PDMS-Geräten erneuert werden, um die teilweise Entfernung der Silanschicht bei jedem Schälschritt zu kompensieren. Andernfalls können die Seitenwände im Fotolackmuster stecken bleiben, wodurch die Form unbrauchbar wird. Da der Kompressionsgrad, der auf die Proben angewendet wird, eine Funktion der mechanischen Eigenschaften der Seitenwände ist, ist es wichtig, die Parameter des PDMS-Replikatformprozesses konsistent zu halten. Das Härterverhältnis, die Temperatur und die Dauer müssen während der Herstellung genau überwacht werden. Da diese Gerätestrategie für die gleichzeitige Anwendung mechanischer Stimulation auf eine große Anzahl von mehrzelligen Organismen ausgelegt ist, kann deren Aggregation innerhalb der Mikrokanäle zu Verstopfungen führen. Obwohl dieses Problem mit den hierin verwendeten Organismen nicht aufgetreten ist, gibt es, falls dies auftritt, mögliche Lösungen aus der Literatur, um dieses Problem zu überwinden, wie z.B. die Verwendung von Trägerlösungen während der Einführung der Proben22.
Obwohl Drosophila-Embryonen in dieser Arbeit als ganzer mehrzelliger Organismus verwendet wurden, kann die hier vorgestellte Design- und Herstellungsstrategie auf die mechanische Stimulation anderer mehrzelliger Systeme angewendet werden, indem die Abmessungen des Geräts entsprechend verändert werden (Abbildung 2). Dies kann erreicht werden, indem die Breite und Höhe des zentralen Mikrokanals an die der mehrzelligen Systeme angepasst wird. Durch diesen Ansatz können Proben in die Mikrokanäle eindringen und in ähnlicher Weise komprimiert werden, indem die verformbaren Seitenwände mit positivem pneumatischem Druck abgelenkt werden. Um diesen Ansatz zu demonstrieren, wurden ähnliche Geräte für Drosophila-Eikammern sowie Gehirnorganoide hergestellt. Diese Systeme ermöglichten die präzise mechanische Kompression dieser biologischen Systeme, ähnlich wie bei den Drosophila-Embryo-Experimenten (Abbildung 6). Da dieser Ansatz die Auffüllung der Medien um die immobilisierten Proben ermöglicht, kann er auch für chemische Stimulationsexperimente sehr nützlich sein, die einen schnellen Medienaustausch erfordern, ohne die Proben zu stören. Insgesamt kombiniert dieser vielseitige Ansatz die Präzisions- und Hochdurchsatz-Automatisierungsfähigkeiten mikrofluidischer Systeme und ermöglicht gleichzeitig neuartige mechanobiologische Studien an verschiedenen mehrzelligen Systemen wie kleinen Gewebeproben, Organoiden, Embryonen und Eizellen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen an den in diesem Manuskript beschriebenen Produkten und haben nichts anderes offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (CMMI-1946456), dem Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) und dem National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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