Fluorescerende in situ hybridisering og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin mærkning for stamlignende celler i hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum

Summary

Her beskriver vi en protokol til visualisering af stammelignende prolifererende celler i vandmændene Cladonema. Helmonteret fluorescerende in situ-hybridisering med en stamcellemarkør muliggør påvisning af stamlignende celler, og 5-ethynyl-2′-deoxyuridinmærkning muliggør identifikation af prolifererende celler. Sammen kan aktivt prolifererende stamlignende celler detekteres.

Abstract

Cnidarians, herunder havanemoner, koraller og vandmænd, udviser forskellig morfologi og livsstil, der manifesteres i sessile polypper og frisvømmende medusae. Som eksemplificeret i etablerede modeller som Hydra og Nematostella bidrager stamceller og / eller proliferative celler til udvikling og regenerering af cnidarian polypper. Imidlertid er de underliggende cellulære mekanismer i de fleste vandmænd, især på medusa-stadiet, stort set uklare, og det er derfor kritisk at udvikle en robust metode til identifikation af specifikke celletyper. Dette papir beskriver en protokol til visualisering af stammelignende prolifererende celler i hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum. Cladonema medusae besidder forgrenede tentakler, der kontinuerligt vokser og opretholder regenerativ kapacitet i hele deres voksne fase, hvilket giver en unik platform til at studere de cellulære mekanismer, der er orkestreret af prolifererende og / eller stamlignende celler. Helmonteret fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) ved hjælp af en stamcellemarkør muliggør påvisning af stamlignende celler, mens pulsmærkning med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU), en S-fasemarkør, muliggør identifikation af prolifererende celler. Ved at kombinere både FISH- og EdU-mærkning kan vi detektere aktivt prolifererende stamceller på faste dyr, og denne teknik kan anvendes bredt på andre dyr, herunder ikke-model vandmændarter.

Introduction

Cnidaria betragtes som en basalt forgrenet metazoan phylum indeholdende dyr med nerver og muskler, hvilket placerer dem i en unik position til at forstå udviklingen af dyreudvikling og fysiologi ^1,2. Cnidarians er kategoriseret i to hovedgrupper: Anthozoa (fx havanemoner og koraller) har kun planula larver og sessile polyp stadier, mens Medusozoa (medlemmer af Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa og Cubozoa) typisk har form af fritsvømmende medusae eller vandmænd samt planula larver og polypper. Cnidarians udviser almindeligvis høj regenerativ kapacitet, og deres underliggende cellulære mekanismer, især deres besiddelse af voksne stamceller og proliferative celler, har tiltrukket sig stor opmærksomhed ^3,4. Oprindeligt identificeret i Hydra er hydrozoanstamceller placeret i de interstitielle rum mellem ektodermale epitelceller og kaldes almindeligvis interstitielle celler eller i-celler³.

Hydrozoan i-celler deler fælles egenskaber, der inkluderer multipotens, ekspression af bredt bevarede stamcellemarkører (f.eks. Nanos, Piwi, Vasa) og migrationspotentiale 3,5,6,7,8. Som funktionelle stamceller er i-celler i vid udstrækning involveret i hydrozodyrs udvikling, fysiologi og miljørespons, hvilket vidner om deres høje regenerative kapacitet og plasticitet³. Mens stamceller, der ligner i-celler, ikke er blevet identificeret uden for hydrozoer, selv i den etablerede modelart Nematostella, er proliferative celler stadig involveret i vedligeholdelse og regenerering af somatisk væv samt kimlinjen⁹. Da undersøgelser i cnidarian udvikling og regenerering overvejende er blevet udført på polyp-type dyr som Hydra, Hydractinia og Nematostella, forbliver den cellulære dynamik og funktioner af stamceller i vandmænd stort set uadresseret.

Hydrozoan vandmænd Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk vandmandsart med forskellige levesteder rundt om i verden, herunder Middelhavet og Nordamerika, er blevet brugt som et eksperimentelt modeldyr i flere udviklings- og evolutionære undersøgelser¹⁰. Med sin lille størrelse, lette håndtering og store æg er Clytia velegnet til laboratorievedligeholdelse samt til introduktion af genetiske værktøjer som de nyligt etablerede transgenese- og knockout-metoder¹¹, hvilket åbner mulighed for detaljeret analyse af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for vandmandsbiologi. I Clytia medusa tentakel er i-celler lokaliseret i den proksimale region, kaldet pæren, og forfædre som nematoblaster migrerer til den distale spids, mens de differentierer sig i forskellige celletyper, herunder nematocytter¹².

Under regenerering af Clytia manubrium migrerer det orale organ af vandmænd, Nanos1⁺ i-celler, der er til stede i gonaderne, til det område, hvor manubrium går tabt som reaktion på skader og deltager i regenerering af manubrium⁷. Disse fund understøtter ideen om, at i-celler i Clytia også opfører sig som funktionelle stamceller, der er involveret i morfogenese og regenerering. I betragtning af at i-cellernes egenskaber adskiller sig blandt repræsentative polyp-type dyr som Hydra og Hydractinia³, er det imidlertid muligt, at stamcellernes egenskaber og funktioner er diversificeret blandt vandmændarter. Med undtagelse af Clytia er eksperimentelle teknikker desuden blevet begrænset for andre vandmænd, og den detaljerede dynamik i proliferative celler og stamceller er ukendt¹³.

Hydrozoan vandmænd Cladonema pacificum er en ny modelorganisme, der kan opbevares i et laboratoriemiljø uden vandpumpe eller filtreringssystem. Cladonema medusa har forgrenede tentakler, et fælles kendetegn i Cladonematidae-familien, og et fotoreceptororgan kaldet ocellus på det ektodermale lag nær pæren¹⁴. Tentakelforgreningsprocessen sker på et nyt forgreningssted, der vises langs den adaksiale side af tentaklen. Over tid fortsætter tentaklerne med at forlænge og forgrene sig, hvor de ældre grene skubbes ud mod spidsen¹⁵. Derudover kan Cladonema tentakler regenerere inden for få dage efter amputation. Nylige undersøgelser har antydet rollen som prolifererende celler og stamlignende celler i tentakelforgrening og regenerering i Cladonema^16,17. Men mens konventionel in situ hybridisering (ISH) er blevet brugt til at visualisere genekspression i Cladonema, på grund af dens lave opløsning, er det i øjeblikket vanskeligt at observere stamcelledynamik på celleniveau i detaljer.

Dette papir beskriver en metode til visualisering af stamlignende celler i Cladonema af FISH og co-farvning med EdU, en markør for celleproliferation¹⁸. Vi visualiserer ekspressionsmønsteret for Nanos1, en stamcellemarkør ^5,17, af FISH^, som gør det muligt at identificere stamlignende cellefordeling på enkeltcelleniveau. Derudover gør co-farvning af Nanos1-ekspression med EdU-mærkning det muligt at skelne aktivt prolifererende stamlignende celler. Denne metode til overvågning af både stamceller og proliferative celler kan anvendes på en lang række undersøgelsesområder, herunder tenakelforgrening, vævshomeostase og organregenerering i Cladonema, og en lignende tilgang kan anvendes på andre vandmændarter.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer relateret til alle materialer, reagenser og udstyr, der anvendes i denne protokol. 1. Sonde syntese RNA-ekstraktionPlacer tre levende Cladonema medusae, der dyrkes i kunstigt havvand (ASW) i et 1,5 ml rør ved hjælp af en 3,1 ml overførselspipette med spidsen afskåret, og fjern så meget ASW som muligt.BEMÆRK: ASW fremstilles ved at opløse en blanding af mineralsalte i ledningsvand …

Representative Results

Cladonema tentakler er blevet brugt som model til at studere de cellulære processer af morfogenese og regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består af et epitelrør, hvor stamlignende celler eller i-celler er placeret i det proksimale område, kaldet tentakelpæren, og nye grene tilføjes sekventielt på bagsiden af pærens distale område langs adaxialsiden (figur 3A)…

Discussion

Formerende celler og stamceller er vigtige cellulære kilder i forskellige processer såsom morfogenese, vækst og regenerering^21,22. Dette papir beskriver en metode til co-farvning af stamcellemarkøren Nanos1 ved FISH og EdU-mærkning i Cladonema medusae. Tidligere arbejde ved hjælp af EdU- eller BrdU-mærkning har antydet, at proliferative celler lokaliserer til tentakelpærerne^{16,17,</sup…}

Materials

2-Mercaptoethanol	Wako	137-06862
3.1 mL transfer pipette	Thermo Scientific	233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Wako	029-15043
anti-DIG-POD	Roche	11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer			5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer			5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer			5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer			5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye	Invitrogen	C10337	EdU kit
Coroline off	GEX Co. ltd	N/A	chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent	Roche	11175041910	blocking buffer
DIG RNA labeling mix	Roche	11277073910
DTT	Promega	P117B
ECOS competent cell DH5α	NIPPON GENE	316-06233	competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit	Fast gene	FG-91302	gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit	Fast gene	FG-90502	plasmid miniprep
Formamide	Wako	068-00426
Heparin sodium salt from porcine	SIGMA-ALDRICH	H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG)	Wako	096-05143
LB Agar	Invitrogen	22700-025	agar plate
LB Broth Base	Invitrogen	12780-052	LB medium
Maleic acid	Wako	134-00495
mini Quick spin RNA columns	Roche	11814427001	clean-up column
NaCl	Wako	191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONEC-W	spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20)	Wako	166-21115
PowerMasher 2	nippi	891300	homogenizer
Proteinase K	Nacarai Tesque	29442-14
RNase Inhibitor	TaKaRa	2313A
RNeasy Mini kit	Qiagen	74004	total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase	Promega	M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC)	TaKaRa	T9172
SEA LIFE	Marin Tech	N/A	mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase	Roche	11031163001
T7 RNA polymerase	Roche	10881767001
TAITEC HB-100	TAITEC	0040534-000	Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A	Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit	TaKaRa	6210A	cDNA synthesis kit
Target Clone	TOYOBO	TAK101	pTA2 Vector
tRNA	Roche	10109541001
TSA Plus Cyanine 5	AKOYA Biosciences	NEL745001KT	tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880	ZEISS	N/A	laser scanning confocal microscope