Hybridation fluorescente in situ et marquage de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine pour les cellules souches de la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum
Summary
Ici, nous décrivons un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche dans la méduse Cladonema. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier avec un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules souches, et le marquage de la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine permet l’identification des cellules proliférantes. Ensemble, des cellules souches proliférant activement peuvent être détectées.
Abstract
Les cnidaires, y compris les anémones de mer, les coraux et les méduses, présentent une morphologie et des modes de vie variés qui se manifestent par des polypes sessiles et des méduses nageant librement. Comme l’illustrent les modèles établis tels que Hydra et Nematostella, les cellules souches et/ou les cellules prolifératives contribuent au développement et à la régénération des polypes cnidaires. Cependant, les mécanismes cellulaires sous-jacents chez la plupart des méduses, en particulier au stade de la méduse, sont largement flous et, par conséquent, le développement d’une méthode robuste pour identifier des types cellulaires spécifiques est essentiel. Cet article décrit un protocole pour visualiser les cellules proliférantes de type souche chez la méduse hydrozoaire Cladonema pacificum. Cladonema medusae possède des tentacules ramifiés qui se développent continuellement et maintiennent une capacité de régénération tout au long de leur stade adulte, fournissant une plate-forme unique pour étudier les mécanismes cellulaires orchestrés par la prolifération et / ou les cellules souches. L’hybridation in situ fluorescente à montage entier (FISH) à l’aide d’un marqueur de cellules souches permet la détection de cellules de type souches, tandis que le marquage par impulsions avec la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU), un marqueur de phase S, permet l’identification des cellules proliférantes. En combinant à la fois l’étiquetage FISH et EdU, nous pouvons détecter la prolifération active de cellules souches sur des animaux fixes, et cette technique peut être largement appliquée à d’autres animaux, y compris des espèces de méduses non modèles.
Introduction
Cnidaria est considéré comme un phylum métazoaire à ramification basale contenant des animaux dotés de nerfs et de muscles, les plaçant dans une position unique pour comprendre l’évolution du développement et de la physiologie des animaux 1,2. Les cnidaires sont classés en deux groupes principaux: les anthozoaires (par exemple, les anémones de mer et les coraux) ne possèdent que des larves de planula et des stades de polypes sessiles, tandis que les méduses (membres des hydrozoaires, des staurozoaires, des scyphozoaires et des cubozoa) prennent généralement la forme de méduses nageant librement, ou méduses, ainsi que de larves et de polypes planula. Les Cnidaires présentent généralement une capacité de régénération élevée, et leurs mécanismes cellulaires sous-jacents, en particulier leur possession de cellules souches adultes et de cellules prolifératives, ont attiré beaucoup d’attention 3,4. Initialement identifiées dans Hydra, les cellules souches hydrozoaires sont situées dans les espaces interstitiels entre les cellules épithéliales ectodermiques et sont communément appelées cellules interstitielles ou cellules i3.
Les cellules i hydrozoaires partagent des caractéristiques communes qui comprennent la multipotence, l’expression de marqueurs de cellules souches largement conservés (par exemple, Nanos, Piwi, Vasa) et le potentiel de migration 3,5,6,7,8. En tant que cellules souches fonctionnelles, les i-cellules sont largement impliquées dans le développement, la physiologie et les réponses environnementales des animaux hydrozoaires, ce qui atteste de leur capacité de régénération élevée et de leur plasticité3. Alors que les cellules souches, similaires aux cellules i, n’ont pas été identifiées en dehors des hydrozoaires, même chez l’espèce modèle établie Nematostella, les cellules prolifératives sont toujours impliquées dans le maintien et la régénération du tissu somatique, ainsi que dans la lignée germinale9. Comme les études sur le développement et la régénération des cnidaires ont été principalement menées sur des animaux de type polype tels que Hydra, Hydractinia et Nematostella, la dynamique cellulaire et les fonctions des cellules souches chez les espèces de méduses restent largement ignorées.
La méduse hydrozoaire Clytia hemisphaerica , une espèce de méduse cosmopolite avec différents habitats à travers le monde, y compris la mer Méditerranée et l’Amérique du Nord, a été utilisée comme animal modèle expérimental dans plusieurs études développementales et évolutives10. Avec sa petite taille, sa manipulation facile et ses œufs volumineux, Clytia convient à l’entretien en laboratoire, ainsi qu’à l’introduction d’outils génétiques tels que les méthodes de transgénèse et d’élimination11 récemment établies, ouvrant la voie à une analyse détaillée des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la biologie des méduses. Dans le tentacule de Clytia medusa, les cellules i sont localisées dans la région proximale, appelée bulbe, et les progéniteurs tels que les nématoblastes migrent vers l’extrémité distale tout en se différenciant en types cellulaires distincts, y compris les nématocytes12.
Lors de la régénération du Clytia manubrium, l’organe buccal des méduses, les cellules Nanos1+ i présentes dans les gonades migrent vers la région où le manubrium est perdu en réponse à des dommages et participent à la régénération du manubrium7. Ces résultats soutiennent l’idée que les cellules i de Clytia se comportent également comme des cellules souches fonctionnelles impliquées dans la morphogenèse et la régénération. Cependant, étant donné que les propriétés des cellules i diffèrent parmi les animaux représentatifs de type polype tels que Hydra et Hydractinia3, il est possible que les caractéristiques et les fonctions des cellules souches soient diversifiées parmi les espèces de méduses. De plus, à l’exception de Clytia, les techniques expérimentales ont été limitées pour les autres méduses, et la dynamique détaillée des cellules prolifératives et des cellules souches est inconnue13.
La méduse hydrozoaire Cladonema pacificum est un organisme modèle émergent qui peut être conservé dans un environnement de laboratoire sans pompe à eau ni système de filtration. Le Cladonema medusa a des tentacules ramifiés, une caractéristique commune dans la famille des Cladonematidae, et un organe photorécepteur appelé ocelle sur la couche ectodermique près du bulbe14. Le processus de ramification du tentacule se produit à un nouveau site de ramification qui apparaît le long du côté adaxial du tentacule. Au fil du temps, les tentacules continuent de s’allonger et de se ramifier, les branches les plus anciennes étant poussées vers la pointe15. De plus, les tentacules du cladonème peuvent se régénérer quelques jours après l’amputation. Des études récentes ont suggéré le rôle des cellules proliférantes et des cellules souches dans la ramification et la régénération des tentacules chez Cladonema16,17. Cependant, alors que l’hybridation in situ conventionnelle (ISH) a été utilisée pour visualiser l’expression génique dans Cladonema, en raison de sa faible résolution, il est actuellement difficile d’observer en détail la dynamique des cellules souches au niveau cellulaire.
Cet article décrit une méthode de visualisation de cellules souches dans Cladonema par FISH et de co-coloration avec EdU, un marqueur de prolifération cellulaire18. Nous visualisons le modèle d’expression de Nanos1, un marqueur de cellules souches 5,17, par FISH, qui permet l’identification de la distribution des cellules souches au niveau de la cellule unique. De plus, la co-coloration de l’expression de Nanos1 avec le marquage EdU permet de distinguer les cellules souches qui prolifèrent activement. Cette méthode de surveillance des cellules souches et des cellules prolifératives peut être appliquée à un large éventail de domaines d’investigation, y compris la ramification des tentacules, l’homéostasie tissulaire et la régénération des organes chez Cladonema, et une approche similaire peut être appliquée à d’autres espèces de méduses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules proliférantes et les cellules souches sont des sources cellulaires importantes dans divers processus tels que la morphogenèse, la croissance et la régénération21,22. Cet article décrit une méthode de co-coloration du marqueur de cellules souches Nanos1 par marquage FISH et EdU chez Cladonema medusae. Des travaux antérieurs utilisant le marquage EdU ou BrdU ont suggéré que les cellules prolifératives se localisent aux bulb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par AMED sous le numéro de subvention JP22gm6110025 (à Y.N.) et par le numéro de subvention JSPS KAKENHI 22H02762 (à Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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