Fluorescerende in situ hybridisatie en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-etikettering voor stamachtige cellen in de hydrozoaire kwal Cladonema pacificum
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van stamachtige prolifererende cellen in de kwal Cladonema. Whole-mount fluorescerende in situ hybridisatie met een stamcelmarker maakt de detectie van stamachtige cellen mogelijk, en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine-etikettering maakt de identificatie van prolifererende cellen mogelijk. Samen kunnen actief prolifererende stamcellen worden gedetecteerd.
Abstract
Cnidarians, waaronder zeeanemonen, koralen en kwallen, vertonen diverse morfologie en levensstijlen die zich manifesteren in sessiele poliepen en vrijzwemmende medusae. Zoals geïllustreerd in gevestigde modellen zoals Hydra en Nematostella, dragen stamcellen en/of proliferatieve cellen bij aan de ontwikkeling en regeneratie van cnidarische poliepen. De onderliggende cellulaire mechanismen in de meeste kwallen, met name in het medusa-stadium, zijn echter grotendeels onduidelijk en daarom is het ontwikkelen van een robuuste methode voor het identificeren van specifieke celtypen van cruciaal belang. Dit artikel beschrijft een protocol voor het visualiseren van stamachtige prolifererende cellen in de hydrozoïsche kwal Cladonema pacificum. Cladonema medusae bezitten vertakte tentakels die voortdurend groeien en het regeneratieve vermogen behouden gedurende hun volwassen stadium, en bieden een uniek platform om de cellulaire mechanismen te bestuderen die worden georkestreerd door prolifererende en / of stamachtige cellen. Whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) met behulp van een stamcelmarker maakt de detectie van stamcellen mogelijk, terwijl pulsetikettering met 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), een S-fasemarker, de identificatie van prolifererende cellen mogelijk maakt. Door zowel FISH- als EdU-etikettering te combineren, kunnen we actief prolifererende stamachtige cellen op vaste dieren detecteren, en deze techniek kan breed worden toegepast op andere dieren, inclusief niet-modelkwallensoorten.
Introduction
Cnidaria wordt beschouwd als een basaal vertakkend metazoazuurphylum dat dieren met zenuwen en spieren bevat, waardoor ze in een unieke positie verkeren om de evolutie van de ontwikkeling en fysiologie van dierente begrijpen 1,2. Cnidarians zijn onderverdeeld in twee hoofdgroepen: Anthozoa (bijv. Zeeanemonen en koralen) bezitten alleen planulalarven en sessiele poliepstadia, terwijl Medusozoa (leden van Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa en Cubozoa) meestal de vorm aannemen van vrijzwemmende medusae of kwallen, evenals planulalarven en poliepen. Cnidarians vertonen vaak een hoge regeneratieve capaciteit en hun onderliggende cellulaire mechanismen, met name hun bezit van volwassen stamcellen en proliferatieve cellen, hebben veel aandacht getrokken 3,4. Hydrozoaire stamcellen, die aanvankelijk in Hydra werden geïdentificeerd, bevinden zich in de interstitiële ruimtes tussen ectodermale epitheelcellen en worden gewoonlijk interstitiële cellen of i-cellengenoemd 3.
Hydrozoaire i-cellen delen gemeenschappelijke kenmerken, waaronder multipotentie, de expressie van breed geconserveerde stamcelmarkers (bijv. Nanos, Piwi, Vasa) en migratiepotentieel 3,5,6,7,8. Als functionele stamcellen zijn i-cellen uitgebreid betrokken bij de ontwikkeling, fysiologie en omgevingsreacties van hydrozoïsche dieren, wat getuigt van hun hoge regeneratieve capaciteit en plasticiteit3. Hoewel stamcellen, vergelijkbaar met i-cellen, niet buiten hydrozoën zijn geïdentificeerd, zijn zelfs in de gevestigde modelsoort Nematostella nog steeds proliferatieve cellen betrokken bij het onderhoud en de regeneratie van somatisch weefsel, evenals de kiembaan9. Aangezien studies in cnidarian ontwikkeling en regeneratie voornamelijk zijn uitgevoerd op poliepachtige dieren zoals Hydra, Hydractinia en Nematostella, blijven de cellulaire dynamiek en functies van stamcellen in kwallensoorten grotendeels onbesproken.
De hydrozoïsche kwal Clytia hemisphaerica, een kosmopolitische kwallensoort met verschillende habitats over de hele wereld, waaronder de Middellandse Zee en Noord-Amerika, is gebruikt als een experimenteel modeldier in verschillende ontwikkelings- en evolutionaire studies10. Met zijn kleine formaat, eenvoudige bediening en grote eieren is Clytia geschikt voor laboratoriumonderhoud, evenals voor de introductie van genetische hulpmiddelen zoals de onlangs gevestigde transgenese- en knock-outmethoden11, waardoor de mogelijkheid wordt geopend voor gedetailleerde analyse van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de kwallenbiologie. In de Clytia medusa-tentakel zijn i-cellen gelokaliseerd in het proximale gebied, de bol genaamd, en voorlopercellen zoals nematoblasten migreren naar de distale punt terwijl ze zich onderscheiden in verschillende celtypen, waaronder nematocyten12.
Tijdens regeneratie van het Clytia-manubrium migreren het orale orgaan van kwallen, Nanos1 + i-cellen die aanwezig zijn in de geslachtsklieren naar het gebied waar het manubrium verloren gaat als reactie op schade en nemen deel aan de regeneratie van het manubrium7. Deze bevindingen ondersteunen het idee dat i-cellen in Clytia zich ook gedragen als functionele stamcellen die betrokken zijn bij morfogenese en regeneratie. Aangezien de eigenschappen van i-cellen echter verschillen tussen representatieve poliepachtige dieren zoals Hydra en Hydractinia3, is het mogelijk dat de kenmerken en functies van stamcellen gediversifieerd zijn tussen kwallensoorten. Bovendien zijn, met uitzondering van Clytia, experimentele technieken beperkt voor andere kwallen en is de gedetailleerde dynamiek van proliferatieve cellen en stamcellen onbekend13.
De hydrozoïsche kwal Cladonema pacificum is een opkomend modelorganisme dat in een laboratoriumomgeving kan worden gehouden zonder waterpomp of filtratiesysteem. De Cladonema medusa heeft vertakte tentakels, een gemeenschappelijk kenmerk in de Cladonematidae-familie, en een fotoreceptororgaan genaamd de ocellus op de ectodermale laag bij de bol14. Het tentakelvertakkingsproces vindt plaats op een nieuwe vertakkingsplaats die langs de adaxiale kant van de tentakel verschijnt. Na verloop van tijd blijven de tentakels uitrekken en vertakken, waarbij de oudere takken naar de punt15 worden geduwd. Bovendien kunnen Cladonema-tentakels binnen enkele dagen na amputatie regenereren. Recente studies hebben de rol van prolifererende cellen en stamachtige cellen in tentakelvertakking en regeneratie in Cladonema 16,17 gesuggereerd. Hoewel conventionele in situ hybridisatie (ISH) is gebruikt om genexpressie in Cladonema te visualiseren, is het vanwege de lage resolutie momenteel moeilijk om stamceldynamica op cellulair niveau in detail te observeren.
Dit artikel beschrijft een methode voor het visualiseren van stamachtige cellen in Cladonema door FISH en co-kleuring met EdU, een marker van celproliferatie18. We visualiseren het expressiepatroon van Nanos1, een stamcelmarker 5,17, door FISH, die de identificatie van stamachtige celverdeling op het niveau van één cel mogelijk maakt. Bovendien maakt de co-kleuring van Nanos1-expressie met EdU-etikettering het mogelijk om actief prolifererende stamachtige cellen te onderscheiden. Deze methode voor het monitoren van zowel stamachtige cellen als proliferatieve cellen kan worden toegepast op een breed scala aan onderzoeksgebieden, waaronder tentakelvertakking, weefselhomeostase en orgaanregeneratie in Cladonema, en een vergelijkbare aanpak kan worden toegepast op andere kwallensoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prolifererende cellen en stamcellen zijn belangrijke cellulaire bronnen in verschillende processen zoals morfogenese, groei en regeneratie21,22. Dit artikel beschrijft een methode voor het co-kleuren van de stamcelmarker Nanos1 door FISH en EdU-etikettering in Cladonema medusae. Eerder werk met behulp van EdU- of BrdU-etikettering heeft gesuggereerd dat proliferatieve cellen lokaliseren naar de tentakelbollen 16,17</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door AMED onder grantnummer JP22gm6110025 (naar Y.N.) en door de JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (naar Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
