Флуоресцентная гибридизация in situ и маркировка 5-этинил-2'-дезоксиуридина для стволовых клеток в гидрозоанской медузе Cladonema pacificum
Summary
Здесь мы описываем протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток в медузе Cladonema. Флуоресцентная гибридизация in situ с маркером стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, а маркировка 5-этинил-2′-дезоксиуридином позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Вместе могут быть обнаружены активно размножающиеся стволовые клетки.
Abstract
Книдарии, в том числе морские анемоны, кораллы и медузы, демонстрируют разнообразную морфологию и образ жизни, которые проявляются в сидячих полипах и свободно плавающих медузах. Как показано на примере установленных моделей , таких как Гидра и Нематостелла, стволовые клетки и / или пролиферативные клетки способствуют развитию и регенерации книдарийных полипов. Тем не менее, основные клеточные механизмы у большинства медуз, особенно на стадии медузы, в значительной степени неясны, и, таким образом, разработка надежного метода идентификации конкретных типов клеток имеет решающее значение. В этой статье описывается протокол визуализации стволовых пролиферирующих клеток у гидрозоанской медузы Cladonema pacificum. Cladonema medusae обладают разветвленными щупальцами, которые непрерывно растут и поддерживают регенеративную способность на протяжении всей своей взрослой стадии, обеспечивая уникальную платформу для изучения клеточных механизмов, организованных пролиферирующими и / или стволовыми клетками. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с использованием маркера стволовых клеток позволяет обнаруживать стволовые клетки, в то время как пульсовая маркировка 5-этинил-2′-дезоксиуридином (EdU), маркером S-фазы, позволяет идентифицировать пролиферирующие клетки. Сочетая маркировку FISH и EdU, мы можем обнаруживать активно размножающиеся стволовые клетки на фиксированных животных, и этот метод может быть широко применен к другим животным, включая немодельные виды медуз.
Introduction
Cnidaria считается базально ветвящимся метазойным типом, содержащим животных с нервами и мышцами, что ставит их в уникальное положение для понимания эволюции развития животных и физиологии 1,2. Книдарии подразделяются на две основные группы: Anthozoa (например, морские анемоны и кораллы) обладают только личинками планулы и сидячими полипами, в то время как Medusozoa (члены Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa и Cubozoa) обычно принимают форму свободно плавающих медуз, или медуз, а также личинок планулы и полипов. Книдарийцы обычно демонстрируют высокую регенеративную способность, и их основные клеточные механизмы, особенно их обладание взрослыми стволовыми клетками и пролиферативными клетками, привлекли большое внимание 3,4. Первоначально идентифицированные у гидры, гидрозоановые стволовые клетки расположены в интерстициальных пространствах между эпителиальными клетками эктодермии и обычно называются интерстициальными клетками или i-клетками3.
Гидрозоановые i-клетки имеют общие характеристики, которые включают мультипотентность, экспрессию широко сохраненных маркеров стволовых клеток (например, Nanos, Piwi, Vasa) и миграционный потенциал 3,5,6,7,8. Как функциональные стволовые клетки, i-клетки активно участвуют в развитии, физиологии и реакциях окружающей среды гидрозоанских животных, что свидетельствует об их высокой регенеративной способности и пластичности3. В то время как стволовые клетки, похожие на i-клетки, не были идентифицированы вне гидрозоанов, даже у установленного модельного вида Nematostella, пролиферативные клетки все еще участвуют в поддержании и регенерации соматической ткани, а также зародышевой линии9. Поскольку исследования в области развития и регенерации книдариев были преимущественно проведены на животных полипового типа, таких как гидра, гидрактиния и нематостелла, клеточная динамика и функции стволовых клеток у видов медуз остаются в значительной степени без внимания.
Гидрозойская медуза Clytia hemisphaerica, космополитический вид медуз с различными местами обитания по всему миру, включая Средиземное море и Северную Америку, была использована в качестве экспериментального модельного животного в нескольких исследованиях развития и эволюции10. Благодаря своим небольшим размерам, простоте обращения и большим яйцам, Clytia подходит для лабораторного обслуживания, а также для внедрения генетических инструментов, таких как недавно установленные методы трансгенеза и нокаута11, открывая возможность для подробного анализа клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе биологии медуз. В щупальце Clytia medusa i-клетки локализуются в проксимальной области, называемой луковицей, а предшественники, такие как нематобласты, мигрируют к дистальной кончику, дифференцируясь в различные типы клеток, включая нематоциты12.
Во время регенерации Clytia manubrium, орального органа медуз, Nanos1+ i-клетки, которые присутствуют в гонадах, мигрируют в область, где манубрий теряется в ответ на повреждение и участвуют в регенерации манубриума7. Эти результаты подтверждают идею о том, что i-клетки в Clytia также ведут себя как функциональные стволовые клетки, которые участвуют в морфогенезе и регенерации. Однако, учитывая, что свойства i-клеток различаются у репрезентативных животных полипового типа, таких как гидра и гидрактиния3, возможно, что характеристики и функции стволовых клеток разнообразны среди видов медуз. Кроме того, за исключением Клитии, экспериментальные методы были ограничены для других медуз, а подробная динамика пролиферативных клеток и стволовых клеток неизвестна13.
Гидрозоанская медуза Cladonema pacificum является новым модельным организмом, который может содержаться в лабораторных условиях без водяного насоса или системы фильтрации. Cladonema medusa имеет разветвленные щупальца, общую характеристику в семействе Cladonematidae, и орган фоторецепторов, называемый ocellus на эктодермальном слое около луковицы14. Процесс ветвления щупальца происходит на новом месте ветвления, которое появляется вдоль адаксиальной стороны щупальца. Со временем щупальца продолжают удлиняться и ветвиться, а старые ветви выталкиваются к кончику15. Кроме того, щупальца Cladonema могут регенерировать в течение нескольких дней после ампутации. Недавние исследования показали роль пролиферирующих клеток и стволовых клеток в разветвлении и регенерации щупальца в Cladonema 16,17. Однако, в то время как обычная гибридизация in situ (ISH) использовалась для визуализации экспрессии генов в Cladonema, из-за ее низкого разрешения в настоящее время трудно наблюдать динамику стволовых клеток на клеточном уровне в деталях.
В данной статье описывается метод визуализации стволовых клеток в Cladonema методом FISH и совместного окрашивания с EdU, маркером пролиферации клеток18. Мы визуализируем паттерн экспрессии Nanos1, маркера стволовых клеток 5,17, с помощью FISH, который позволяет идентифицировать распределение стволовых клеток на уровне одной клетки. Кроме того, совместное окрашивание экспрессии Nanos1 маркировкой EdU позволяет различать активно пролиферирующие стволовые клетки. Этот метод мониторинга как стволовых, так и пролиферативных клеток может быть применен к широкому спектру исследуемых областей, включая ветвление щупалец, гомеостаз тканей и регенерацию органов при кладонеме, и аналогичный подход может быть применен к другим видам медуз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пролиферирующие клетки и стволовые клетки являются важными клеточными источниками в различных процессах, таких как морфогенез, рост и регенерация21,22. В данной статье описывается способ совместного окрашивания маркера стволовых клеток Nanos1 с помощь…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана AMED под номером гранта JP22gm6110025 (к Y.N.) и грантом JSPS KAKENHI No 22H02762 (к Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
