ヒドロ虫クラゲクラドネマパシフィカムにおける幹細胞様細胞の蛍光In situハイブリダイゼーションと5-エチニル-2'-デオキシウリジン標識
Summary
ここでは、クラゲ クラドネーマにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコールについて述べる。幹細胞マーカーとのホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーションは幹細胞様細胞の検出を可能にし、5-エチニル-2′-デオキシウリジン標識は増殖細胞の同定を可能にします。一緒に、活発に増殖している幹細胞様細胞を検出することができる。
Abstract
イソギンチャク、サンゴ、クラゲなどの刺胞動物は、固着性ポリープや自由に泳ぐメデューサに現れる多様な形態とライフスタイルを示します。 ヒドラ や ネマトステラなどの確立されたモデルに例示されるように、幹細胞および/または増殖細胞は刺胞動物ポリープの発生と再生に寄与します。しかし、ほとんどのクラゲの根底にある細胞メカニズム、特にメデューサの段階はほとんど不明であるため、特定の細胞タイプを特定するための堅牢な方法を開発することが重要です。この論文は、ヒドロ虫クラゲ Cladonema pacificumにおける茎様増殖細胞を可視化するためのプロトコルを記載する。 Cladonema medusaeは、成体期を通じて継続的に成長し、再生能力を維持する分岐触手を備えており、増殖細胞および/または幹細胞様細胞によって調整される細胞メカニズムを研究するための独自のプラットフォームを提供します。幹細胞マーカーを用いたホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)は幹細胞様細胞の検出を可能にし、S期マーカーである5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)によるパルス標識は増殖細胞の同定を可能にします。FISH標識とEdU標識を組み合わせることで、固定動物で活発に増殖している幹細胞を検出することができ、この手法は非モデルクラゲ種を含む他の動物にも広く適用できます。
Introduction
刺胞動物は、神経と筋肉を持つ動物を含む基本的に分岐した後生動物門と考えられており、動物の発生と生理学の進化を理解するためのユニークな位置にあります1,2。刺胞動物は2つの主要なグループに分類されます:アントゾア(イソギンチャクやサンゴなど)はプラヌラ幼虫と固着性ポリープステージのみを持っていますが、メドゥソゾア(ヒドロゾア、スタウロゾア、シフォゾア、キュボゾアのメンバー)は通常、遊泳するメデューサ、またはクラゲ、およびプラヌラの幼虫とポリープの形をとります。刺胞動物は一般的に高い再生能力を示し、その根底にある細胞メカニズム、特に成体幹細胞と増殖細胞の所有が大きな注目を集めています3,4。Hydraで最初に同定されたヒドロ虫幹細胞は、外胚葉上皮細胞間質間質に位置し、一般に間質細胞またはi細胞と呼ばれます3。
ヒドロ虫i細胞は、多能性、広く保存されている幹細胞マーカー(Nanos、Piwi、Vasaなど)の発現、および遊走の可能性3,5,6,7,8を含む共通の特徴を共有しています。機能的な幹細胞として、i細胞はヒドロ虫動物の発生、生理学、環境応答に広く関与しており、その高い再生能力と可塑性を証明しています3。幹細胞は、i細胞と同様に、ヒドロ虫以外では同定されていませんが、確立されたモデル種である線虫でさえ、増殖細胞は依然として体細胞組織および生殖系列の維持と再生に関与しています9。刺胞動物の発生と再生に関する研究は、主にヒドラ、ヒドラクチニア、ネマトステラなどのポリープ型動物で行われてきたため、クラゲ種の幹細胞の細胞動態と機能はほとんど取り上げられていません。
ヒドロ虫クラゲ Clytia hemisphaerica は、地中海や北米を含む世界中で異なる生息地を持つ国際的なクラゲ種であり、いくつかの発生および進化研究で実験モデル動物として利用されています10。サイズが小さく、取り扱いが簡単で卵が大きいため、 Clytia は実験室でのメンテナンスや、最近確立されたトランスジェネシスやノックアウト法などの遺伝ツールの導入に適しており11、クラゲの生物学の根底にある細胞および分子メカニズムの詳細な分析の機会を開きます。 Clytia medusa触手では、i細胞は球根と呼ばれる近位領域に局在し、線虫などの前駆細胞は線虫細胞を含む異なる細胞型に分化しながら遠位先端に移動します12。
クラゲの口腔器官であるClytia manubriumの再生中に、生殖腺に存在するNanos1+ i細胞は、損傷に応答してマヌブリウムが失われる領域に移動し、マニュブリウム7の再生に関与します。これらの知見は、Clytiaのi細胞が、形態形成と再生に関与する機能的な幹細胞としても振る舞うという考えを支持している。しかし、ヒドラやヒドラクチニア3などの代表的なポリープ型動物ではi細胞の性質が異なることから、クラゲ種間で幹細胞の特性や機能が多様化している可能性があります。さらに、Clytiaを除いて、他のクラゲの実験技術は限られており、増殖細胞と幹細胞の詳細な動態は不明です13。
ヒドロ虫クラゲCladonema pacificumは、ウォーターポンプやろ過システムなしで実験室環境で保管できる新しいモデル生物です。クラドネマメデューサは、クラドネマ科に共通する特徴である枝分かれした触手と、球根14近くの外胚葉層に卵子と呼ばれる光受容体器官を持っています。触手分岐プロセスは、触手の軸方向に沿って現れる新しい分岐部位で発生します。時間が経つにつれて、触手は伸びて枝分かれし続け、古い枝は先端15に向かって押し出されます。さらに、クラドネーマの触手は切断後数日以内に再生する可能性があります。最近の研究では、クラドネーマの触手の分岐と再生における増殖細胞と幹細胞のような細胞の役割が示唆されています16,17。しかし、従来のin situハイブリダイゼーション(ISH)は、クラドネーマの遺伝子発現を可視化するために利用されてきましたが、分解能が低いため、幹細胞の動態を細胞レベルで詳細に観察することは現在のところ困難です。
この論文では、FISHによってクラドネーマの幹細胞様細胞を可視化し、細胞増殖のマーカーであるEdUと共染色する方法について説明しています18。幹細胞マーカー5,17であるNanos1の発現パターンをFISHで可視化することで、幹細胞様細胞の分布を1細胞レベルで同定することができます。さらに、Nanos1発現とEdU標識の共染色により、活発に増殖している幹細胞様細胞を区別することができます。幹細胞様細胞と増殖細胞の両方をモニタリングするこの方法は、クラドネーマにおける触手の分岐、組織の恒常性、臓器再生など、幅広い研究分野に適用でき、同様のアプローチは他のクラゲ種にも適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
増殖細胞および幹細胞は、形態形成、成長、および再生などの様々な過程において重要な細胞源である21,22。この論文では、クラドネマメデューサにおけるFISHおよびEdU標識によって幹細胞マーカーNanos1を共染色する方法について説明しています。EdUまたはBrdU標識を用いた以前の研究では、増殖細胞が触手球根に局在することが示唆さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、AMEDの課題番号JP22gm6110025(Y.N.宛)およびJSPS科研費22H02762(Y.N.宛)の支援を受けて行われました。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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