הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.
Abstract
קנידריאנים, כולל שושנות ים, אלמוגים ומדוזות, מפגינים מורפולוגיה ואורחות חיים מגוונים המתבטאים בפוליפים ססיליים ובמדוזות שחייה חופשית. כפי שמודגם במודלים מבוססים כגון הידרה ונמטוסטלה, תאי גזע ו/או תאים מתרבים תורמים להתפתחות והתחדשות של פוליפים קנידריים. עם זאת, המנגנונים התאיים הבסיסיים ברוב המדוזות, במיוחד בשלב המדוזה, אינם ברורים במידה רבה, ולכן פיתוח שיטה איתנה לזיהוי סוגי תאים ספציפיים הוא קריטי. מאמר זה מתאר פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum. ל-Cladonema medusae יש זרועות ציד מסועפות שגדלות ללא הרף ושומרות על יכולת התחדשות לאורך כל שלב הבוגרים שלהן, ומספקות פלטפורמה ייחודית שבאמצעותה ניתן לחקור את המנגנונים התאיים המתוזמרים על ידי תאים מתרבים ו/או דמויי גזע. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה (FISH) באמצעות סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, בעוד תיוג פולסים עם 5-אתיניל-2′-דאוקסיורידין (EdU), סמן שלב S, מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. בשילוב של תיוג FISH ו-EdU, אנו יכולים לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל על בעלי חיים קבועים, וטכניקה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על בעלי חיים אחרים, כולל מיני מדוזות שאינן דוגמניות.
Introduction
Cnidaria נחשב לגוף מטזואני מסתעף בסיסי המכיל בעלי חיים עם עצבים ושרירים, מה שמציב אותם בעמדה ייחודית להבנת האבולוציה של התפתחות בעלי חייםופיזיולוגיה 1,2. קנידרים מסווגים לשתי קבוצות עיקריות: אנתוזואה (למשל, שושנות ים ואלמוגים) הם בעלי זחלי פלנולה בלבד ושלבי פוליפ ססיליים, בעוד שמדוסוזואה (חברי הידרוזואה, סטאורוזואה, סקיפוזואה וקובוזואה) לובשים בדרך כלל צורה של מדוזה בשחייה חופשית, או מדוזות, כמו גם זחלי פלנולה ופוליפים. קנידריאנים מפגינים בדרך כלל יכולת התחדשות גבוהה, והמנגנונים התאיים הבסיסיים שלהם, במיוחד החזקתם בתאי גזע בוגרים ובתאים מתרבים, משכו תשומת לב רבה 3,4. תאי גזע הידרוזואניים, שזוהו לראשונה בהידרה, ממוקמים בחללים הבין-תאיים שבין תאי אפיתל אקטודרמליים והם מכונים בדרך כלל תאים אינטרסטיציאליים או תאי i3.
תאי i הידרוזואניים חולקים מאפיינים משותפים הכוללים ריבוי פוטנציות, ביטוי של סמני תאי גזע שהשתמרו באופן נרחב (למשל, נאנוס, פיווי, ואסה), ופוטנציאל נדידה 3,5,6,7,8. כתאי גזע פונקציונליים, תאי i מעורבים באופן נרחב בהתפתחות, בפיזיולוגיה ובתגובות הסביבתיות של בעלי חיים הידרוזואניים, מה שמעיד על יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהםופלסטיותם 3. בעוד שתאי גזע, בדומה לתאי i, לא זוהו מחוץ להידרוזואנים, אפילו במין המודל המבוסס Nematostella, תאים מתרבים עדיין מעורבים בתחזוקה והתחדשות של רקמות סומטיות, כמו גם בקו הנבט9. מכיוון שמחקרים בהתפתחות והתחדשות של מדוזות נערכו בעיקר על בעלי חיים מסוג פוליפ כמו הידרה, הידרקטיניה ונמטוסטלה, הדינמיקה התאית והתפקודים של תאי גזע במיני מדוזות נותרו ברובם ללא שינוי.
המדוזה ההידרוזואנית Clytia hemisphaerica , מין מדוזה קוסמופוליטית עם בתי גידול שונים ברחבי העולם, כולל הים התיכון וצפון אמריקה, שימשה כחיית מודל ניסיונית במספר מחקרים התפתחותיים ואבולוציוניים10. עם גודלה הקטן, הטיפול הקל והביציות הגדולות שלה, Clytia מתאימה לתחזוקת מעבדה, כמו גם להכנסת כלים גנטיים כגון שיטות הטרנסגנזה והנוקאאוטשנקבעו לאחרונה 11, מה שפותח את ההזדמנות לניתוח מפורט של המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס הביולוגיה של המדוזות. בזרועות הציד Clytia medusa , תאי i ממוקמים באזור הפרוקסימלי, הנקרא הנורה, ואבות אבים כגון נמטובלסטים נודדים לקצה הדיסטלי תוך התמיינות לסוגי תאים שונים, כולל נמטוציטים12.
במהלך התחדשות של Clytia manubrium, איבר הפה של מדוזות, Nanos1 + i-תאים הנמצאים בגונדות נודדים לאזור שבו manubrium הוא איבד בתגובה לנזק ולהשתתף התחדשות של manubrium7. ממצאים אלה תומכים ברעיון שתאי i בקליטיה מתנהגים גם כתאי גזע פונקציונליים המעורבים במורפוגנזה ובהתחדשות. עם זאת, בהתחשב בכך המאפיינים של תאי i שונים בין בעלי חיים מייצגים מסוג פוליפ כגון הידרה ו Hydractinia3, ייתכן כי המאפיינים והפונקציות של תאי גזע מגוונים בין מיני מדוזות. יתר על כן, למעט קליטיה, טכניקות ניסיוניות הוגבלו עבור מדוזות אחרות, והדינמיקה המפורטת של תאים מתרבים ותאי גזע אינה ידועה13.
המדוזה ההידרוזואנית Cladonema pacificum היא אורגניזם מודל מתפתח שניתן לשמור בסביבת מעבדה ללא משאבת מים או מערכת סינון. למדוזה Cladonema יש זרועות ציד מסועפות, מאפיין נפוץ במשפחת Cladonematidae, ואיבר פוטורצפטור הנקרא ocellus בשכבה האקטודרמלית ליד הנורה14. תהליך הסתעפות זרועות הציד מתרחש באתר הסתעפות חדש המופיע לאורך הצד האדאקסיאלי של זרוע הציד. עם הזמן, זרועות הציד ממשיכות להתארך ולהסתעף, כאשר הענפים הישנים נדחקים החוצה לכיוון קצה15. בנוסף, זרועות הקלדונמה יכולות להתחדש תוך מספר ימים לאחר קטיעה. מחקרים אחרונים הציעו את תפקידם של תאים מתרבים ותאים דמויי גזע בהסתעפות זרועות ציד והתחדשות בקלדונמה16,17. עם זאת, בעוד הכלאה קונבנציונלית באתרה (ISH) נוצלה כדי לדמיין ביטוי גנים בקלדונמה, בשל הרזולוציה הנמוכה שלה, כיום קשה לצפות בדינמיקה של תאי גזע ברמה התאית בפירוט.
מאמר זה מתאר שיטה להדמיית תאים דמויי גזע בקלדונמה על ידי FISH וצביעה משותפת עם EdU, סמן של התפשטות תאים18. אנו מדמיינים את תבנית הביטוי של Nanos1, סמן תאי גזע 5,17, על ידי FISH, המאפשרת זיהוי של התפלגות תאים דמויי גזע ברמת התא הבודד. בנוסף, הצביעה המשותפת של ביטוי Nanos1 עם תיוג EdU מאפשרת להבחין בין תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל. שיטה זו לניטור תאים דמויי גזע ותאים מתרבים יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של אזורי חקירה, כולל הסתעפות זרועות ציד, הומאוסטזיס רקמות והתחדשות איברים בקלדונמה, וגישה דומה יכולה להיות מיושמת על מיני מדוזות אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאים מתרבים ותאי גזע הם מקורות תאיים חשובים בתהליכים שונים כגון מורפוגנזה, גדילה והתחדשות21,22. מאמר זה מתאר שיטה להכתמה משותפת של סמן תאי הגזע Nanos1 על ידי תיוג FISH ו- EdU ב- Cladonema medusae. עבודות קודמות שהשתמשו בתיוג EdU או BrdU הציעו כי תאים מתרבים מתמקמים לנור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי AMED תחת מענק מספר JP22gm6110025 (ל- Y.N.) ועל ידי מענק JSPS KAKENHI מספר 22H02762 (ל- Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
