Fluorescerande in situ-hybridisering och 5-etynyl-2'-deoxiuridinmärkning för stamliknande celler i hydrozomaneten Cladonema pacificum
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i maneten Cladonema. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering med en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, och 5-etynyl-2′-deoxiuridinmärkning möjliggör identifiering av prolifererande celler. Tillsammans kan aktivt prolifererande stamliknande celler detekteras.
Abstract
Cnidarians, inklusive havsanemoner, koraller och maneter, uppvisar olika morfologi och livsstilar som manifesteras i sessila polyper och frisimmande medusae. Som exemplifieras i etablerade modeller som Hydra och Nematostella bidrar stamceller och/eller proliferativa celler till utveckling och regenerering av cnidariska polyper. De underliggande cellulära mekanismerna i de flesta maneter, särskilt i medusastadiet, är dock till stor del oklara, och därför är det viktigt att utveckla en robust metod för att identifiera specifika celltyper. Detta dokument beskriver ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i hydrozoan maneter Cladonema pacificum. Cladonema medusae har grenade tentakler som kontinuerligt växer och upprätthåller regenerativ kapacitet under hela sitt vuxna stadium, vilket ger en unik plattform för att studera de cellulära mekanismerna som orkestreras av prolifererande och / eller stamliknande celler. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering (FISH) med hjälp av en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, medan pulsmärkning med 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU), en S-fasmarkör, möjliggör identifiering av prolifererande celler. Genom att kombinera både FISH- och EdU-märkning kan vi upptäcka aktivt prolifererande stamliknande celler på fasta djur, och denna teknik kan tillämpas brett på andra djur, inklusive maneter som inte är modeller.
Introduction
Cnidaria anses vara en basalt förgrenande metazoisk fylum som innehåller djur med nerver och muskler, vilket placerar dem i en unik position för att förstå utvecklingen av djurutveckling och fysiologi 1,2. Cnidarians kategoriseras i två huvudgrupper: Anthozoa (t.ex. havsanemoner och koraller) har endast planulalarver och sessila polypstadier, medan Medusozoa (medlemmar av Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa och Cubozoa) vanligtvis har formen av frisimmande medusae eller maneter, liksom planula larver och polyper. Cnidarians uppvisar vanligtvis hög regenerativ kapacitet, och deras underliggande cellulära mekanismer, särskilt deras innehav av vuxna stamceller och proliferativa celler, har väckt stor uppmärksamhet 3,4. Ursprungligen identifierade i Hydra är hydrozoa stamceller belägna i de interstitiella utrymmena mellan ektodermala epitelceller och kallas vanligtvis interstitiella celler eller i-celler3.
Hydrozoa i-celler delar gemensamma egenskaper som inkluderar multipotens, uttryck av allmänt bevarade stamcellsmarkörer (t.ex. Nanos, Piwi, Vasa) och migrationspotential 3,5,6,7,8. Som funktionella stamceller är i-celler i stor utsträckning involverade i utveckling, fysiologi och miljörespons hos hydrozoa djur, vilket vittnar om deras höga regenerativa kapacitet och plasticitet3. Medan stamceller, som liknar i-celler, inte har identifierats utanför hydrozoer, även i den etablerade modellarten Nematostella, är proliferativa celler fortfarande involverade i underhåll och regenerering av somatisk vävnad, liksom bakterielinjen9. Eftersom studier i cnidarisk utveckling och regenerering huvudsakligen har utförts på polyp-typ djur som Hydra, Hydractinia och Nematostella, förblir den cellulära dynamiken och funktionerna hos stamceller i manetarter i stort sett oadresserade.
Den hydrozoiska maneten Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk manetart med olika livsmiljöer runt om i världen, inklusive Medelhavet och Nordamerika, har använts som ett experimentellt modelldjur i flera utvecklings- och evolutionära studier10. Med sin lilla storlek, enkla hantering och stora ägg är Clytia lämplig för laboratorieunderhåll, liksom för introduktion av genetiska verktyg som de nyligen etablerade transgenes- och knockoutmetoderna11, vilket öppnar möjligheten för detaljerad analys av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för manetbiologi. I Clytia medusa-tentakeln är i-celler lokaliserade i den proximala regionen, kallad glödlampan, och förfäder som nematoblaster migrerar till den distala spetsen medan de differentieras till distinkta celltyper, inklusive nematocyter12.
Under regenerering av Clytia manubrium migrerar det orala organet av maneter, Nanos1+ i-celler som finns i gonaderna till regionen där manubriet går förlorat som svar på skador och deltar i regenereringen av manubrium7. Dessa fynd stöder tanken att i-celler i Clytia också beter sig som funktionella stamceller som är involverade i morfogenes och regenerering. Med tanke på att egenskaperna hos i-celler skiljer sig åt bland representativa polyp-typ djur såsom Hydra och Hydractinia3, är det möjligt att stamcellernas egenskaper och funktioner är diversifierade bland manetarter. Dessutom, med undantag för Clytia, har experimentella tekniker begränsats för andra maneter, och den detaljerade dynamiken hos proliferativa celler och stamceller är okänd13.
Den hydrozoa maneten Cladonema pacificum är en framväxande modellorganism som kan hållas i laboratoriemiljö utan vattenpump eller filtreringssystem. Cladonema medusa har grenade tentakler, en vanlig egenskap i familjen Cladonematidae, och ett fotoreceptororgan som kallas ocellus på det ektodermala skiktet nära glödlampan14. Tentakelförgreningsprocessen sker vid en ny förgreningsplats som visas längs tentakelns adaxiala sida. Med tiden fortsätter tentaklerna att förlängas och förgrena sig, med de äldre grenarna som skjuts ut mot spetsen15. Dessutom kan Cladonema-tentakler regenerera inom några dagar vid amputation. Nya studier har föreslagit rollen av prolifererande celler och stamliknande celler i tentakelförgrening och regenerering i Cladonema16,17. Men medan konventionell in situ-hybridisering (ISH) har använts för att visualisera genuttryck i Cladonema, på grund av dess låga upplösning, är det för närvarande svårt att observera stamcellsdynamik på cellnivå i detalj.
Denna artikel beskriver en metod för att visualisera stamliknande celler i Cladonema av FISH och samfärgning med EdU, en markör för cellproliferation18. Vi visualiserar uttrycksmönstret för Nanos1, en stamcellsmarkör 5,17, av FISH, vilket möjliggör identifiering av stamliknande cellfördelning på encellsnivå. Dessutom gör samfärgningen av Nanos1-uttryck med EdU-märkning det möjligt att skilja aktivt prolifererande stamliknande celler. Denna metod för övervakning av både stamliknande celler och proliferativa celler kan tillämpas på ett brett spektrum av undersökningsområden, inklusive tentakelförgrening, vävnadshomeostas och organregenerering i Cladonema, och ett liknande tillvägagångssätt kan tillämpas på andra manetarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prolifererande celler och stamceller är viktiga cellulära källor i olika processer såsom morfogenes, tillväxt och regenerering21,22. Denna artikel beskriver en metod för att samfärga stamcellsmarkören Nanos1 med FISH och EdU-märkning i Cladonema medusae. Tidigare arbete med EdU- eller BrdU-märkning har föreslagit att proliferativa celler lokaliseras till tentakellökarna16,17,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av AMED under bidragsnummer JP22gm6110025 (till Y.N.) och av JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (till Y.N.).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L., Boutet, A., Shierwater, B. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. , 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -. C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
