Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie
Summary
Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.
Abstract
Aptameren zijn doelherkenningsmoleculen die binden met een hoge affiniteit en specificiteit. Deze kenmerken kunnen worden gebruikt om andere moleculen met signaalgeneratievermogen te besturen. Voor het hierin beschreven systeem activeert doelherkenning via een aptamerisch domein, Stem II van een gemodificeerd hamerkopribozym, het zelfsplitsende ribozym door de aanvankelijk ongestructureerde constructie te stabiliseren. Het cis-splijtende RNA werkt op de kruising van Stem III en Stem I, waardoor twee splitsingsproducten ontstaan. Het langere splitsingsproduct primeert een isothermische exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) van de twee vergelijkbaar katalytisch actieve G-quadruplexen. Die resulterende amplificatieproducten katalyseren peroxidasereductie, die is gekoppeld aan de reductie van een colorimetrisch substraat met een uitgang die het blote oog kan detecteren. Het 3-delige systeem dat in deze studie wordt beschreven, verbetert detectiemodaliteiten zoals enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA’s) door een visueel detecteerbaar signaal te produceren voor het aangeven van de aanwezigheid van zo laag als 0,5 μM theofylline in slechts 15 minuten.
Introduction
Aptameren zijn typisch enkelstrengs DNA of RNA geselecteerd door een evolutionair proces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit aan de gewenste doelen1. Naast het bindingsvermogen kunnen aptameren worden gekoppeld aan en besturingsmotieven met signaaluitgangsfuncties2,3, waardoor het signaal wordt versterkt en de gevoeligheid van het systeem wordt verbeterd. Het G-quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie (GQ-EXPAR) systeem is een driedelig systeem (figuur 1) dat een visueel signaal ontwikkelt als opeenvolgende componenten worden toegevoegd aan een enkel reactievat om een visuele outputte produceren 4. Dit systeem maakt de detectie van een specifiek doelwit, hierin theofylline, in een bepaald monster binnen 15 minuten mogelijk met behulp van een gestroomlijnde workflow om snelle, specifieke detectie van een interessant doelwit mogelijk te maken. Deze methode moet worden overwogen voor monsters waarbij een specifieke kwantificering van de doelconcentratie een lager belang heeft dan een hoge specificiteit van de respons in een korte tijd.
Een allosterische riboswitch, een structuurveranderend RNA-molecuul (ribozym) dat zelfsplitsing ondergaat, produceert het initiële signaal. Deze constructie is gebaseerd op het hamerhaairibozym, met een aptamerisch domein geïntroduceerd in Stem II als regulator van splitsingsactiviteit. De zelfsplitsingsfunctie wordt geactiveerd wanneer het aptamere domein wordt gestabiliseerd bij binding aan zijn doel5. Anders is de switch inactief in de oorspronkelijke staat.
De daaropvolgende exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) gebruikt de afgifte van de zelfgesplitste RNA-streng uit de eerste fase om een isotherme amplificatiereactie te primen6. Het amplificatieproduct van EXPAR heeft peroxidase-activiteit7, die fungeert als basis voor de laatste fase van het systeem. Wanneer sommige substraten worden geoxideerd in combinatie met peroxideafbraak, produceren ze een fluorescerende output die kan worden gemeten op verschillende instrumenten. Andere veel voorkomende substraten kunnen worden vervangen om een gekleurd product te produceren voor visuele detectie. EXPAR en de peroxidase-activiteit van zijn amplificatieproducten fungeren als een 2-traps signaalversterker, waardoor de gevoeligheid tot grotere niveaus wordt verhoogd in vergelijking met conventionele strategieën 7,8.
De detectie van theofylline versus cafeïne wordt gebruikt als een voorbeeld van de specificiteit van dit detectieplatform, omdat ze slechts door een enkele methylgroep verschillen (figuur 2). Deze demonstratie van het systeem produceert een colorimetrische output voor visuele detectie van ten minste 500 nM theofylline.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van de overgang tussen een aanvankelijk ongeordende secundaire structuur in een allosterisch ribozym en de extra stabiliteit die wordt verleend door de binding van het doelwit aan het aptamere domein om het cis-splitsende hamerhaairibozym te activeren. De stabiliteit van het ribozym werd aangepast om katalytische activiteit te minimaliseren in afwezigheid van het doelwit, terwijl doelbinding de actieve structuur kon herstellen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat de buffe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
