Rilevamento del bersaglio basato su aptamero facilitato da una reazione di amplificazione esponenziale isoterma G-quadruplex a 3 stadi
Summary
Il presente protocollo dimostra l’uso di un saggio di amplificazione esponenziale veloce, a 3 stadi, basato su aptamero per rilevare bersagli. La preparazione del campione, l’amplificazione del segnale e lo sviluppo del colore sono coperti per implementare questo sistema per riconoscere la presenza di teofillina rispetto a quella della caffeina.
Abstract
Gli aptameri sono molecole di riconoscimento del bersaglio che si legano con alta affinità e specificità. Queste caratteristiche possono essere sfruttate per controllare altre molecole con capacità di generazione del segnale. Per il sistema qui descritto, il riconoscimento del bersaglio attraverso un dominio aptamerico, Stem II di un ribozima martello modificato, attiva il ribozima auto-scisso stabilizzando il costrutto inizialmente non strutturato. L’RNA cis-cscissione agisce alla giunzione di Stem III e Stem I, creando due prodotti di scissione. Il prodotto di scissione più lungo innesca una reazione di amplificazione esponenziale isotermica (EXPAR) dei due G-quadruplex cataliticamente attivi simili. I prodotti di amplificazione risultanti catalizzano la riduzione della perossidasi, che è accoppiata alla riduzione di un substrato colorimetrico con un output che l’occhio nudo può rilevare. Il sistema in 3 parti descritto nel presente studio migliora le modalità di rilevamento come i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) producendo un segnale visivamente rilevabile per indicare la presenza di una minima parte di 0,5 μM di teofillina in appena 15 minuti.
Introduction
Gli aptameri sono tipicamente DNA o RNA a singolo filamento selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati1. Oltre alla capacità di legame, gli aptameri possono essere collegati e controllare motivi con funzioni di uscita del segnale2,3, amplificando detto segnale e migliorando la sensibilità del sistema. Il sistema G-quadruplex isothermal exponential amplification reaction (GQ-EXPAR) è un sistema in tre parti (Figura 1) che sviluppa un segnale visivo quando componenti successivi vengono aggiunti a un singolo recipiente di reazione per produrre un output visivo4. Questo sistema consente di rilevare un bersaglio specifico, qui teofillina, in un dato campione entro 15 minuti utilizzando un flusso di lavoro semplificato per consentire un rilevamento rapido e specifico di un target di interesse. Questo metodo deve essere preso in considerazione per i campioni in cui la quantificazione specifica della concentrazione target è una preoccupazione inferiore rispetto all’elevata specificità della risposta in un breve lasso di tempo.
Un ribointerruttore allosterico, una molecola di RNA a commutazione di struttura (ribozima) che subisce l’auto-scissione, produce il segnale iniziale. Questo costrutto è basato sul ribozima martello, con un dominio aptamerico introdotto nello Stem II come regolatore dell’attività di scissione. La sua funzione di autoscissione si attiva quando il suo dominio aptamerico è stabilizzato legandosi al suo bersaglio5. In caso contrario, l’opzione è inattiva nello stato nativo.
La successiva reazione di amplificazione esponenziale (EXPAR) utilizza il rilascio del filamento di RNA auto-scisso dal primo stadio per innescare una reazione di amplificazione isoterma6. Il prodotto di amplificazione di EXPAR ha attività perossidasi7, che funge da base per l’ultimo stadio del sistema. Quando alcuni substrati vengono ossidati in concomitanza con la rottura del perossido, producono un’uscita fluorescente che può essere misurata su vari strumenti. Altri substrati comuni possono essere sostituiti per produrre un prodotto colorato per il rilevamento visivo. EXPAR e l’attività perossidasica dei suoi prodotti di amplificazione agiscono come un potenziatore del segnale a 2 stadi, aumentando la sensibilità a livelli maggiori rispetto alle strategie convenzionali 7,8.
La rilevazione della teofillina rispetto alla caffeina è usata come esempio della specificità di questa piattaforma di rilevazione, in quanto differiscono solo per un singolo gruppo metilico (Figura 2). Questa dimostrazione del sistema produce un output colorimetrico per il rilevamento visivo di almeno 500 nM di teofillina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato sfrutta la transizione tra una struttura secondaria inizialmente disordinata in un ribozima allosterico e la stabilità aggiuntiva conferita attraverso il legame del bersaglio al dominio aptamerico per attivare il ribozima martello cis-scissione. La stabilità del ribozima è stata regolata per ridurre al minimo l’attività catalitica in assenza del bersaglio, consentendo al contempo il legame del bersaglio per ripristinare la struttura attiva. Inoltre, è necessario prestare attenzione a bilanci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal finanziamento per la ricerca e lo sviluppo di Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
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