Обнаружение целей на основе аптамеров, чему способствует 3-ступенчатая G-квадруплексная изотермическая реакция экспоненциального усиления
Summary
Настоящий протокол демонстрирует использование быстрого 3-ступенчатого анализа экспоненциального усиления на основе аптамеров для обнаружения целей. Подготовка образцов, усиление сигнала и проявление цвета рассматриваются для реализации этой системы для распознавания присутствия теофиллина по сравнению с присутствием кофеина.
Abstract
Аптамеры представляют собой молекулы распознавания мишеней, которые связываются с высоким сродством и специфичностью. Эти характеристики могут быть использованы для управления другими молекулами, способными генерировать сигналы. Для системы, описанной в настоящем описании, распознавание мишени через аптамерный домен, Stem II модифицированного рибозима молоткоголового типа, активирует саморасщепляющийся рибозим путем стабилизации первоначально неструктурированной конструкции. Цис-расщепляющая РНК действует на стыке Stem III и Stem I, создавая два продукта расщепления. Более длинное произведение расщепления запускает изотермическую реакцию экспоненциального усиления (EXPAR) двух подобных каталитически активных G-квадруплексов. Эти результирующие продукты амплификации катализируют восстановление пероксидазы, которое связано с восстановлением колориметрического субстрата с выходом, который может быть обнаружен невооруженным глазом. Система, состоящая из 3 частей, описанная в настоящем исследовании, улучшает методы обнаружения, такие как иммуноферментные анализы (ИФА), производя визуально обнаруживаемый сигнал, указывающий на присутствие всего 0,5 мкМ теофиллина всего за 15 минут.
Introduction
Аптамеры обычно представляют собой одноцепочечную ДНК или РНК, отобранную в ходе эволюционного процесса с высоким сродством и специфичностью связывания с желаемыми мишенями1. В дополнение к связывающей способности, аптамеры могут быть связаны и управлять мотивами с функциями сигнала-вывода2,3, усиливая указанный сигнал и улучшая чувствительность системы. Система G-квадруплексной изотермической реакции экспоненциального усиления (GQ-EXPAR) представляет собой трехчастную систему (рис. 1), которая развивает визуальный сигнал при добавлении последовательных компонентов в один реакционный сосуд для получения визуального выхода4. Эта система позволяет обнаруживать конкретную мишень, в данном случае теофиллин, в данном образце в течение 15 минут, используя оптимизированный рабочий процесс, чтобы обеспечить быстрое и специфическое обнаружение интересующей цели. Этот метод следует рассматривать для образцов, где конкретное количественное определение целевой концентрации является меньшей проблемой, чем высокая специфичность ответа за короткий промежуток времени.
Аллостерический рибопереключатель, молекула РНК (рибозим), которая подвергается саморасщеплению, производит начальный сигнал. Эта конструкция основана на рибозиме-молотке с аптамерным доменом, введенным в Stem II в качестве регулятора активности расщепления. Его функция саморасщепления активируется, когда его аптамерный домен стабилизируется при связывании с мишенью5. В противном случае коммутатор неактивен в исходном состоянии.
Последующая реакция экспоненциальной амплификации (EXPAR) использует высвобождение саморасщепляющейся цепи РНК с первой стадии для запуска изотермической реакции амплификации6. Продукт амплификации EXPAR обладает пероксидазной активностью7, выступая в качестве основы для последней стадии системы. Когда некоторые субстраты окисляются в сочетании с распадом перекиси, они производят флуоресцентный выход, который можно измерить на различных приборах. Другие распространенные субстраты могут быть заменены для получения цветного продукта для визуального обнаружения. EXPAR и пероксидазная активность его продуктов амплификации действуют как 2-ступенчатый усилитель сигнала, повышая чувствительность к более высоким уровням по сравнению с традиционными стратегиями 7,8.
Обнаружение теофиллина по сравнению с кофеином используется в качестве примера специфичности этой платформы обнаружения, поскольку они различаются только одной метильной группой (рис. 2). Эта демонстрация системы дает колориметрический выход для визуального обнаружения теофиллина не менее 500 нМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь способ использует преимущества перехода между первоначально неупорядоченной вторичной структурой в аллостерическом рибозиме и дополнительной стабильностью, обеспечиваемой связыванием мишени с аптамерным доменом для активации цис-расщепляющего молоткоголово…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано финансированием исследований и разработок от Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
