Détection de cible basée sur des aptamères facilitée par une réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex en 3 étapes
Summary
Le présent protocole démontre l’utilisation d’un test d’amplification exponentielle rapide en 3 étapes, basé sur des aptamères, pour détecter des cibles. La préparation des échantillons, l’amplification du signal et le développement de la couleur sont couverts pour mettre en œuvre ce système afin de reconnaître la présence de théophylline par rapport à celle de la caféine.
Abstract
Les aptamères sont des molécules de reconnaissance de cibles qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées. Ces caractéristiques peuvent être exploitées pour contrôler d’autres molécules ayant une capacité de génération de signal. Pour le système décrit ici, la reconnaissance de cible par un domaine aptamérique, Stem II d’un ribozyme à tête de marteau modifié, active le ribozyme auto-clivant en stabilisant la construction initialement non structurée. L’ARN clivant le cis agit à la jonction de la tige III et de la tige I, créant deux produits de clivage. Le produit de clivage plus long amorce une réaction d’amplification exponentielle isotherme (EXPAR) des deux G-quadruplexes catalytiquement actifs similaires. Ces produits d’amplification qui en résultent catalysent la réduction de la peroxydase, qui est couplée à la réduction d’un substrat colorimétrique avec une sortie que l’œil nu peut détecter. Le système en 3 parties décrit dans la présente étude améliore les modalités de détection telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA) en produisant un signal visuellement détectable pour indiquer la présence de théophylline aussi faible que 0,5 μM en aussi peu que 15 minutes.
Introduction
Les aptamères sont généralement de l’ADN ou de l’ARN simple brin sélectionnés par un processus évolutif avec une affinité et une spécificité de liaison élevées pour les cibles souhaitées1. En plus de la capacité de liaison, les aptamères peuvent être reliés et contrôler des motifs avec des fonctions signal-sortie2,3, amplifiant ledit signal et améliorant la sensibilité du système. Le système de réaction d’amplification exponentielle isotherme G-quadruplex (GQ-EXPAR) est un système en trois parties (Figure 1) qui développe un signal visuel lorsque des composants successifs sont ajoutés à une seule cuve de réaction pour produire une sortie visuelle4. Ce système permet la détection d’une cible spécifique, la théophylline, dans un échantillon donné en 15 minutes en utilisant un flux de travail rationalisé pour permettre une détection rapide et spécifique d’une cible d’intérêt. Cette méthode doit être envisagée pour les échantillons pour lesquels la quantification spécifique de la concentration cible est moins préoccupante que la spécificité élevée de la réponse dans un court laps de temps.
Un riboswitch allostérique, une molécule d’ARN à changement de structure (ribozyme) qui subit un auto-clivage, produit le signal initial. Cette construction est basée sur le ribozyme requin-marteau, avec un domaine aptamique introduit dans Stem II comme régulateur de l’activité de clivage. Sa fonction d’auto-clivage est activée lorsque son domaine aptamique est stabilisé lors de la liaison à sa cible5. Sinon, le commutateur est inactif dans son état natif.
La réaction d’amplification exponentielle suivante (EXPAR) utilise la libération du brin d’ARN auto-clivé du premier étage pour amorcer une réaction d’amplification isotherme6. Le produit d’amplification d’EXPAR a une activité peroxydase7, servant de base à la dernière étape du système. Lorsque certains substrats sont oxydés en conjonction avec la dégradation du peroxyde, ils produisent une sortie fluorescente qui peut être mesurée sur divers instruments. D’autres substrats courants peuvent être substitués pour produire un produit coloré pour la détection visuelle. EXPAR et l’activité peroxydase de ses produits d’amplification agissent comme un amplificateur de signal à 2 étages, augmentant la sensibilité à des niveaux plus élevés par rapport aux stratégies conventionnelles 7,8.
La détection de la théophylline par rapport à la caféine est utilisée comme exemple de la spécificité de cette plateforme de détection, car ils ne diffèrent que par un seul groupe méthyle (Figure 2). Cette démonstration du système produit une sortie colorimétrique pour la détection visuelle d’au moins 500 nM de théophylline.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici tire parti de la transition entre une structure secondaire initialement désordonnée dans un ribozyme allostérique et la stabilité supplémentaire conférée par la liaison de la cible au domaine aptamique pour activer le ribozyme à tête marteau clivant cis. La stabilité du ribozyme a été ajustée pour minimiser l’activité catalytique en l’absence de la cible tout en permettant à la liaison de la cible de restaurer la structure active. De plus, il faut veiller à équilibrer les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le financement de la recherche et du développement d’Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
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