Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Summary

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Abstract

Aptamere sind Zielerkennungsmoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität binden. Diese Eigenschaften können genutzt werden, um andere Moleküle mit der Fähigkeit zur Signalerzeugung zu steuern. Für das hier beschriebene System aktiviert die Zielerkennung durch eine aptamere Domäne, Stamm II eines modifizierten Hammerkopf-Ribozyms, das selbstspaltende Ribozym, indem das anfänglich unstrukturierte Konstrukt stabilisiert wird. Die cis-spaltende RNA wirkt an der Verbindungsstelle von Stamm III und Stamm I, wodurch zwei Spaltprodukte entstehen. Das längere Spaltprodukt führt zu einer isothermen exponentiellen Amplifikationsreaktion (EXPAR) der beiden ähnlichen katalytisch aktiven G-Quadruplexe. Diese resultierenden Amplifikationsprodukte katalysieren die Peroxidase-Reduktion, die mit der Reduktion eines kolorimetrischen Substrats mit einer Leistung gekoppelt ist, die mit bloßem Auge wahrgenommen werden kann. Das in der vorliegenden Studie beschriebene 3-teilige System verbessert Nachweismodalitäten wie Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), indem es in nur 15 Minuten ein visuell detektierbares Signal erzeugt, das das Vorhandensein von nur 0,5 μM Theophyllin anzeigt.

Introduction

Aptamere sind in der Regel einzelsträngige DNA oder RNA, die durch einen evolutionären Prozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität für die gewünschten Ziele ausgewählt werden¹. Zusätzlich zur Bindungsfähigkeit können Aptamere mit Motiven verknüpft werden und diese mit Signalausgangsfunktionen^2,3 steuern^, wodurch das Signal verstärkt und die Empfindlichkeit des Systems verbessert wird. Das G-Quadruplex-System der isothermen exponentiellen Verstärkungsreaktion (GQ-EXPAR) ist ein dreiteiliges System (Abbildung 1), das ein visuelles Signal entwickelt, wenn aufeinanderfolgende Komponenten zu einem einzigen Reaktionsgefäß hinzugefügt werden, um einen visuellen Ausgang⁴ zu erzeugen. Dieses System ermöglicht den Nachweis eines bestimmten Ziels, hierin Theophyllin, in einer gegebenen Probe innerhalb von 15 Minuten unter Verwendung eines optimierten Arbeitsablaufs, um eine schnelle, spezifische Detektion eines Ziels von Interesse zu ermöglichen. Diese Methode muss für Proben in Betracht gezogen werden, bei denen eine spezifische Quantifizierung der Zielkonzentration weniger besorgniserregend ist als eine hohe Spezifität der Reaktion in kurzer Zeit.

Ein allosterischer Riboschalter, ein strukturwechselndes RNA-Molekül (Ribozym), das sich selbst spaltet, erzeugt das initiale Signal. Dieses Konstrukt basiert auf dem Hammerhai-Ribozym, wobei in Stamm II eine aptamere Domäne als Regulator der Spaltaktivität eingeführt wurde. Seine Selbstspaltungsfunktion wird aktiviert, wenn seine aptamere Domäne bei der Bindung an sein Ziel^{stabilisiert wird 5}. Andernfalls ist der Switch in seinem nativen Zustand inaktiv.

Die anschließende exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR) nutzt die Freisetzung des selbstgespaltenen RNA-Strangs aus der ersten Stufe, um eine isotherme Amplifikationsreaktion⁶ auszulösen. Das Amplifikationsprodukt von EXPAR hat die Peroxidaseaktivität⁷, die als Grundlage für die letzte Stufe des Systems dient. Wenn einige Substrate in Verbindung mit dem Peroxidabbau oxidiert werden, erzeugen sie eine Fluoreszenzleistung, die mit verschiedenen Geräten gemessen werden kann. Andere gängige Substrate können ersetzt werden, um ein farbiges Produkt für die visuelle Detektion herzustellen. EXPAR und die Peroxidaseaktivität seiner Amplifikationsprodukte wirken als 2-stufiger Signalverstärker, der die Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Strategien auf höhere Konzentrationen erhöht ^7,8.

Der Nachweis von Theophyllin im Vergleich zu Koffein wird als Beispiel für die Spezifität dieser Nachweisplattform verwendet, da sie sich nur um eine einzige Methylgruppe unterscheiden (Abbildung 2). Diese Demonstration des Systems erzeugt einen kolorimetrischen Ausgang für den visuellen Nachweis von mindestens 500 nM Theophyllin.

Protocol

Siehe Ergänzende Tabelle 1 (die Reaktionsaufbautabelle) für die Herstellung von Röhrchen, einschließlich der spezifischen Volumina und Konzentrationen der Reaktionskomponenten. Das hier demonstrierte Protokoll verwendet ein vormontiertes Detektionsplattform-Kit, wie in der Materialtabelle beschrieben. Alle Komponenten müssen auf Eis gelagert werden, sofern nicht anders angegeben. 1. Herstellung von Ribozym HINWEI…

Representative Results

Die in Abbildung 1 dargestellte Detektionsplattform wandelt die aptamerische Zielerkennung in kurzer Zeit in visuell deutliche Unterschiede zwischen den Probenpräparaten (Target vs. Nicht-Ziel, Abbildung 2) um. Ein allosterisches Ribozym, das von Soukup et al.5 identifiziert wurde, diente als Ausgangspunkt für die Erstellung einer weniger verrauschten Sequenz mit Reaktion auf das Target über die Kontroll- und Negativproben. Das optimie…

Discussion

Die hier vorgestellte Methode nutzt den Übergang zwischen einer anfänglich ungeordneten Sekundärstruktur in einem allosterischen Ribozym und der zusätzlichen Stabilität, die durch die Bindung des Ziels an die aptamere Domäne verliehen wird, um das cis-spaltende Hammerkopf-Ribozym zu aktivieren. Die Stabilität des Ribozyms wurde angepasst, um die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Targets zu minimieren und gleichzeitig die Bindung des Targets zur Wiederherstellung der aktiven Struktur zu ermöglichen. Darü…

Materials

3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.