एपटामर-आधारित लक्ष्य का पता लगाने के लिए 3-स्टेज जी-चौगुनी इज़ोटेर्मल घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया की सुविधा प्रदान की गई
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल लक्ष्यों का पता लगाने के लिए एक तेज, 3-चरण, एपटामर-आधारित घातीय प्रवर्धन परख के उपयोग को दर्शाता है। कैफीन पर थियोफिलाइन की उपस्थिति को पहचानने के लिए इस प्रणाली को लागू करने के लिए नमूना तैयार करना, संकेत प्रवर्धन और रंग विकास को कवर किया जाता है।
Abstract
एपटामर लक्ष्य-पहचान अणु हैं जो उच्च आत्मीयता और विशिष्टता के साथ बंधते हैं। सिग्नल-जनरेशन क्षमता वाले अन्य अणुओं को नियंत्रित करने के लिए इन विशेषताओं का लाभ उठाया जा सकता है। यहां वर्णित प्रणाली के लिए, एक एप्टामेरिक डोमेन के माध्यम से लक्ष्य पहचान, एक संशोधित हैमरहेड राइबोजाइम का स्टेम II, शुरू में असंरचित निर्माण को स्थिर करके स्व-क्लीवर राइबोजाइम को सक्रिय करता है। सीआईएस-क्विंग आरएनए स्टेम III और स्टेम I के जंक्शन पर कार्य करता है, जिससे दो क्लीवेज उत्पाद बनते हैं। लंबी दरार उत्पाद दो समान उत्प्रेरक रूप से सक्रिय जी-चौगुनी की इज़ोटेर्मल घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (एक्सपीएआर) को दर्शाता है। उन परिणामी प्रवर्धन उत्पाद पेरोक्सीडेज कमी को उत्प्रेरित करते हैं, जो एक आउटपुट के साथ एक रंगीन सब्सट्रेट की कमी के साथ युग्मित होता है जिसे नग्न आंखें पता लगा सकती हैं। वर्तमान अध्ययन में वर्णित 3-भाग प्रणाली 15 मिनट से भी कम समय में 0.5 μM थियोफिलाइन की उपस्थिति को इंगित करने के लिए एक नेत्रहीन पता लगाने योग्य संकेत का उत्पादन करके एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसेस (ईएलआईएसए) जैसे पहचान के तौर-तरीकों में सुधार करती है।
Introduction
एपटामर आमतौर पर एकल-फंसे हुए डीएनए या आरएनए होते हैं जिन्हें वांछितलक्ष्यों के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता के साथ एक विकासवादी प्रक्रिया के माध्यम से चुना जाता है। बाध्यकारी क्षमता के अलावा, एपटामर को सिग्नल-आउटपुट फ़ंक्शन 2,3 के साथ रूपांकनों से जोड़ा और नियंत्रित किया जा सकता है, उक्त सिग्नल को बढ़ाता है और सिस्टम की संवेदनशीलता में सुधार करता है। जी-चौगुनी आइसोथर्मल घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (जीक्यू-एक्सपीआर) प्रणाली एक तीन-भाग प्रणाली (चित्रा 1) है जो एक दृश्य संकेत विकसित करती है क्योंकि दृश्य आउटपुट4 का उत्पादन करने के लिए एक एकल प्रतिक्रिया पोत में क्रमिक घटक जोड़े जाते हैं। यह प्रणाली एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो का उपयोग करके किसी दिए गए नमूने में एक विशिष्ट लक्ष्य का पता लगाने की अनुमति देती है, यहां थियोफिलाइन में, एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो का उपयोग करके रुचि के लक्ष्य का तेजी से, विशिष्ट पता लगाने की अनुमति देता है। इस विधि को उन नमूनों के लिए माना जाना चाहिए जहां लक्ष्य एकाग्रता की विशिष्ट मात्रा कम समय में प्रतिक्रिया की उच्च विशिष्टता की तुलना में कम चिंता का विषय है।
एक एलोस्टेरिक राइबोस्विच, एक संरचना-स्विचिंग आरएनए अणु (राइबोजाइम) जो आत्म-दरार से गुजरता है, प्रारंभिक संकेत पैदा करता है। यह निर्माण हैमरहेड राइबोजाइम पर आधारित है, जिसमें दरार गतिविधि के नियामक के रूप में स्टेम II में एक एप्टामेरिक डोमेन पेश किया गया है। इसका स्व-दरार फ़ंक्शन सक्रिय होता है जब इसका एप्टामेरिक डोमेन अपने लक्ष्य5 से बंधन पर स्थिर हो जाता है। अन्यथा, स्विच अपनी मूल स्थिति में निष्क्रिय है।
बाद की घातीय प्रवर्धन प्रतिक्रिया (एक्सपीएआर) पहले चरण से इज़ोटेर्मल प्रवर्धन प्रतिक्रिया6 तक स्व-क्लीवर आरएनए स्ट्रैंड की रिहाई का उपयोग करती है। एक्सपीआर के प्रवर्धन उत्पाद में पेरोक्सीडेज गतिविधि7 है, जो सिस्टम के अंतिम चरण के आधार के रूप में कार्य करता है। जब कुछ सब्सट्रेट्स को पेरोक्साइड ब्रेकडाउन के साथ ऑक्सीकरण किया जाता है, तो वे एक फ्लोरोसेंट आउटपुट का उत्पादन करते हैं जिसे विभिन्न इंस्ट्रूमेंटेशन पर मापा जा सकता है। दृश्य पहचान के लिए रंगीन उत्पाद का उत्पादन करने के लिए अन्य सामान्य सब्सट्रेट्स को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक्सपीआर और इसके प्रवर्धन उत्पादों की पेरोक्सीडेज गतिविधि 2-चरण सिग्नल-एन्हांसर के रूप में कार्य करती है,पारंपरिक रणनीतियों 7,8 की तुलना में अधिक स्तर तक संवेदनशीलता बढ़ाती है।
थियोफिलाइन बनाम कैफीन का पता लगाने का उपयोग इस पहचान मंच की विशिष्टता के उदाहरण के रूप में किया जाता है, क्योंकि वे केवल एक मिथाइल समूह (चित्रा 2) से भिन्न होते हैं। सिस्टम का यह प्रदर्शन कम से कम 500 एनएम थियोफिलाइन के दृश्य का पता लगाने के लिए एक रंगीन आउटपुट पैदा करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विधि एक एलोस्टेरिक राइबोजाइम में शुरू में अव्यवस्थित माध्यमिक संरचना के बीच संक्रमण का लाभ उठाती है और सीआईएस-क्लीवरिंग हैमरहेड राइबोजाइम को सक्रिय करने के लिए लक्ष्य को एप्टामेरिक ड?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एप्टाजेन एलएलसी से अनुसंधान और विकास फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
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