Aptamerbasert måldeteksjon tilrettelagt av en 3-trinns G-quadruplex isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon
Summary
Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av en rask, 3-trinns, aptamerbasert eksponentiell amplifikasjonsanalyse for å oppdage mål. Prøvepreparering, signalforsterkning og fargeutvikling dekkes for å implementere dette systemet for å gjenkjenne tilstedeværelsen av teofyllin over koffein.
Abstract
Aptamerer er målgjenkjenningsmolekyler som binder seg med høy affinitet og spesifisitet. Disse egenskapene kan utnyttes til å kontrollere andre molekyler med signalgenereringsevne. For systemet beskrevet her, målgjenkjenning gjennom et aptamerisk domene, Stem II av et modifisert hammerhead ribozyme, aktiverer den selvspaltende ribozymet ved å stabilisere den opprinnelig ustrukturerte konstruksjonen. CIS-spaltende RNA virker ved krysset mellom Stem III og Stem I, og skaper to spaltningsprodukter. Det lengre spaltningsproduktet primer en isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon (EXPAR) av de to lignende katalytisk aktive G-quadruplexene. De resulterende amplifikasjonsproduktene katalyserer peroksidasereduksjon, som er koblet til reduksjonen av et kolorimetrisk substrat med en utgang som det blotte øye kan oppdage. Det 3-delte systemet beskrevet i denne studien forbedrer deteksjonsmodaliteter som enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA) ved å produsere et visuelt detekterbart signal for å indikere tilstedeværelsen av så lavt som 0,5 μM teofyllin på så lite som 15 minutter.
Introduction
Aptamere er vanligvis enkeltstrenget DNA eller RNA valgt gjennom en evolusjonær prosess med høy bindingsaffinitet og spesifisitet til de ønskede målene1. I tillegg til bindingsevne kan aptamere knyttes til og kontrollere motiver med signalutgangsfunksjoner2,3, noe som forsterker signalet og forbedrer systemets følsomhet. G-quadruplex isotermisk eksponentiell amplifikasjonsreaksjon (GQ-EXPAR) -systemet er et tredelt system (figur 1) som utvikler et visuelt signal når suksessive komponenter legges til en enkelt reaksjonsbeholder for å produsere en visuell utgang4. Dette systemet gjør det mulig å oppdage et spesifikt mål, her teofyllin, i en gitt prøve innen 15 minutter ved hjelp av en strømlinjeformet arbeidsflyt for å muliggjøre rask, spesifikk påvisning av et mål av interesse. Denne metoden må vurderes for prøver der spesifikk kvantifisering av målkonsentrasjonen er en lavere bekymring enn høy spesifisitet av responsen på kort tid.
En allosterisk riboswitch, et strukturbyttende RNA-molekyl (ribozyme) som gjennomgår selvspaltning, produserer det første signalet. Denne konstruksjonen er basert på hammerhead ribozyme, med et aptamerisk domene introdusert i Stem II som en regulator av spaltningsaktivitet. Dens selvspaltningsfunksjon aktiveres når det aptameriske domenet stabiliseres ved binding til målet5. Ellers er bryteren inaktiv i sin opprinnelige tilstand.
Den påfølgende eksponentielle amplifikasjonsreaksjonen (EXPAR) bruker frigjøringen av den selvspaltede RNA-strengen fra første trinn for å prime en isotermisk amplifikasjonsreaksjon6. Forsterkningsproduktet til EXPAR har peroksidaseaktivitet7, som virker som grunnlag for den siste fasen av systemet. Når noen substrater oksideres i forbindelse med peroksidnedbrytning, produserer de en fluorescerende utgang som kan måles på forskjellige instrumenter. Andre vanlige substrater kan erstattes for å produsere et farget produkt for visuell deteksjon. EXPAR og peroksidaseaktiviteten til forsterkningsproduktene fungerer som en 2-trinns signalforsterker, og øker følsomheten for større nivåer sammenlignet med konvensjonelle strategier 7,8.
Deteksjon av teofyllin versus koffein brukes som et eksempel på spesifisiteten til denne deteksjonsplattformen, da de bare avviker med en enkelt metylgruppe (figur 2). Denne demonstrasjonen av systemet produserer en kolorimetrisk utgang for visuell deteksjon av minst 500 nM teofyllin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteres her utnytter overgangen mellom en opprinnelig uordnet sekundær struktur i et allosterisk ribozyme og den ekstra stabiliteten som gis gjennom bindingen av målet til det aptameriske domenet for å aktivere cis-spaltende hammerhode ribozyme. Stabiliteten til ribozymet ble justert for å minimere katalytisk aktivitet i fravær av målet, samtidig som målbindingen ble tillatt for å gjenopprette den aktive strukturen. I tillegg må det tas hensyn til å balansere bufferne til de mange enzymene som k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av forsknings- og utviklingsfinansiering fra Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
