Aptamerbaserad måldetektering underlättad av en 3-stegs G-quadruplex isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion
Summary
Det nuvarande protokollet demonstrerar användningen av en snabb, 3-stegs, aptamerbaserad exponentiell förstärkningsanalys för att detektera mål. Provberedning, signalförstärkning och färgutveckling omfattas för att implementera detta system för att känna igen närvaron av teofyllin över koffein.
Abstract
Aptamerer är måligenkänningsmolekyler som binder med hög affinitet och specificitet. Dessa egenskaper kan utnyttjas för att styra andra molekyler med signalgenereringskapacitet. För det system som beskrivs häri aktiverar måligenkänning genom en aptamerisk domän, stam II av ett modifierat hammarhuvudribozym, det självklyvande ribozymet genom att stabilisera den initialt ostrukturerade konstruktionen. Cis-klyvande RNA verkar vid korsningen av stam III och stam I, vilket skapar två klyvningsprodukter. Den längre klyvningsprodukten primar en isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion (EXPAR) av de två liknande katalytiskt aktiva G-quadruplexerna. De resulterande amplifieringsprodukterna katalyserar peroxidasreduktion, som är kopplad till reduktionen av ett kolorimetriskt substrat med en utgång som blotta ögat kan detektera. Det 3-delade systemet som beskrivs i den aktuella studien förbättrar detektionsmodaliteter såsom enzymbundna immunosorbentanalyser (ELISA) genom att producera en visuellt detekterbar signal för att indikera närvaron av så lågt som 0,5 μM teofyllin på så lite som 15 minuter.
Introduction
Aptamerer är typiskt enkelsträngat DNA eller RNA som valts genom en evolutionär process med hög bindningsaffinitet och specificitet till de önskade målen1. Förutom bindningsförmåga kan aptamerer kopplas till och styra motiv med signalutgångsfunktioner2,3, förstärka nämnda signal och förbättra systemets känslighet. G-quadruplex isotermisk exponentiell förstärkningsreaktion (GQ-EXPAR) -systemet är ett tredelat system (figur 1) som utvecklar en visuell signal när successiva komponenter läggs till ett enda reaktionskärl för att producera en visuell utgång4. Detta system möjliggör detektering av ett specifikt mål, här teofyllin, i ett givet prov inom 15 minuter med hjälp av ett strömlinjeformat arbetsflöde för att möjliggöra snabb, specifik detektering av ett mål av intresse. Denna metod måste övervägas för prover där en specifik kvantifiering av målkoncentrationen ger mindre anledning till oro än en hög specificitet hos responsen på kort tid.
En allosterisk riboswitch, en strukturomsättande RNA-molekyl (ribozym) som genomgår självklyvning, producerar den initiala signalen. Denna konstruktion är baserad på hammarhuvudet ribozym, med en aptamera domän introducerad i stam II som en regulator för klyvningsaktivitet. Dess självklyvningsfunktion aktiveras när dess aptamera domän stabiliseras vid bindning till dess mål5. Annars är växeln inaktiv i sitt ursprungliga tillstånd.
Den efterföljande exponentiella förstärkningsreaktionen (EXPAR) använder frisättningen av den självklyvda RNA-strängen från det första steget för att prima en isotermisk förstärkningsreaktion6. Förstärkningsprodukten av EXPAR har peroxidasaktivitet7, som fungerar som grund för det sista steget i systemet. När vissa substrat oxideras i samband med peroxidnedbrytning producerar de en fluorescerande utgång som kan mätas på olika instrument. Andra vanliga substrat kan ersättas för att producera en färgad produkt för visuell detektering. EXPAR och peroxidasaktiviteten hos dess förstärkningsprodukter fungerar som en 2-stegs signalförstärkare, vilket ökar känsligheten för högre nivåer jämfört med konventionella strategier 7,8.
Detektionen av teofyllin kontra koffein används som ett exempel på specificiteten hos denna detektionsplattform, eftersom de skiljer sig åt med endast en enda metylgrupp (figur 2). Denna demonstration av systemet ger en kolorimetrisk utgång för visuell detektion av minst 500 nM teofyllin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som presenteras här utnyttjar övergången mellan en initialt oordnad sekundär struktur i ett allosteriskt ribozym och den ytterligare stabilitet som ges genom bindningen av målet till den aptamera domänen för att aktivera cis-klyvande hammarhuvudribozym. Ribozymets stabilitet justerades för att minimera katalytisk aktivitet i frånvaro av målet samtidigt som målbindningen kunde återställa den aktiva strukturen. Dessutom måste man vara noga med att balansera buffertarna av de flera enzymer som krävs f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av forsknings- och utvecklingsfinansieringen från Aptagen LLC.
Materials
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tang, J., Breaker, R. R. Rational design of allosteric ribozymes. Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Liao, A. M., et al. A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy. Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).
- Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection. Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
- Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening. Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).
- Nie, J., et al. Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing. Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).
- Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. Cell-free riboswitches. RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).
- Ao, Y., et al. Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker. ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).
