منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية
Summary
يقدم هذا البحث بروتوكول تصنيع لنوع جديد من الركيزة المستزرعة مع مئات الحاويات الدقيقة لكل مم2 ، حيث يمكن استزراع الكائنات العضوية ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة. كما يتم تفصيل بروتوكولات بذر الخلايا وتلطيخ المناعة.
Abstract
إن توصيف عدد كبير من الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) (organoids) بمقاييس دقة مختلفة محدود حاليا بواسطة مناهج التصوير القياسية. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد رقائق الثقافة العضوية الدقيقة ، والتي تتيح التصوير المباشر متعدد المقاييس 3D على أداة سهلة الاستخدام تتطلب الحد الأدنى من التلاعب وقادرة على ما يصل إلى 300 من إنتاجية التصوير العضوي / ساعة. تتوافق رقائق الاستزراع هذه مع كل من أهداف الهواء والغمر (الهواء والماء والزيت والسيليكون) ومجموعة واسعة من المجاهر الشائعة (على سبيل المثال ، القرص الدوار ، والماسح الضوئي المحوري ، والمجال الواسع ، والحقل الساطع). علاوة على ذلك ، يمكن استخدامها مع طرائق ورقة الضوء مثل تقنية مجهر الإضاءة أحادي الهدف أحادي المستوى (SPIM).
يقدم البروتوكول الموصوف هنا خطوات مفصلة لإعداد رقائق الاستزراع الدقيقة وزراعة وتلطيخ المواد العضوية. لا يلزم سوى فترة زمنية قصيرة للتعرف عليها ، ويمكن العثور بسهولة على المواد الاستهلاكية والمعدات في المختبرات الحيوية العادية. هنا ، سيتم عرض قدرات التصوير ثلاثي الأبعاد فقط باستخدام المجاهر القياسية التجارية (على سبيل المثال ، القرص الدوار لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري واسع المجال للمراقبة الروتينية).
Introduction
في ثقافات الخلايا العضوية 3D ، المشار إليها فيما يلي باسم organoids ، تتمايز الخلايا الجذعية وتنظم نفسها في هياكل مكانية تشترك في أوجه تشابه مورفولوجية ووظيفية قوية مع الأعضاء الحقيقية. تقدم الكائنات العضوية نماذج قيمة لدراسة البيولوجيا البشرية والتنمية خارج الجسم1،2،3. يتم تطوير عدد متزايد من النماذج التي تحاكي الكبد والدماغ والكلى والرئة والعديد من الأعضاء الأخرى2،4،5. يتم توجيه التمايز في المواد العضوية عن طريق إضافة عوامل نمو قابلة للذوبان ومصفوفة خارج الخلية في تسلسل زمني دقيق. ومع ذلك ، في تناقض ملحوظ مع الأعضاء ، فإن تطور المواد العضوية غير متجانس تماما.
بالإضافة إلى العديد من التحديات البيولوجية6،7 ، تشكل الثقافات العضوية أيضا تحديات تكنولوجية من حيث طرق زراعة الخلايا ، وتوصيف النسخ ، والتصوير. يحدث تطور الأعضاء في الجسم الحي في بيئة بيولوجية تؤدي إلى تنظيم ذاتي نمطي للغاية لترتيبات الخلايا. يمكن استخدام أي تغيير في النمط الظاهري كوكيل لتشخيص حالة مريضة. في المقابل ، تتطور الكائنات العضوية في المختبر في بيئات دقيقة يتم التحكم فيها بالحد الأدنى ومتوافقة مع ظروف زراعة الخلايا ، مما يؤدي إلى تباين كبير في مسار التطوير وتشكيل الشكل لكل عضو عضوي فردي.
أظهرت دراسة حديثة8 أن التصوير الكمي للشكل العضوي (واصفات النمط الظاهري) إلى جانب تقييم عدد قليل من العلامات الجينية يسمح بتعريف المناظر الطبيعية لتطور النمط الظاهري. يمكن القول إن القدرة على ربط تنوع التعبير الجيني في الكائنات العضوية بسلوكها الظاهري هي خطوة رئيسية نحو إطلاق العنان للإمكانات الكاملة للثقافات العضوية. وبالتالي ، فإنه يطرح لتطوير مناهج تصوير مخصصة وعالية المحتوى تسمح بتوصيف الميزات العضوية في المقاييس تحت الخلوية والمتعددة الخلايا والعضوية الكاملة في 3D 9,10.
لقد طورنا منصة فحص عالية المحتوى (HCS) متعددة الاستخدامات تسمح بزراعة عضوية مبسطة (من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعزولة [hESCs] ، أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان [hIPSCs] ، أو الخلايا الأولية إلى 3D ، متعددة الخلايا ، عضويات متباينة) وتصوير ثلاثي الأبعاد سريع وغير جراحي. إنه يدمج الجيل التالي ، مصغر ، جهاز زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد ، يسمى رقاقة JeWells ( الشريحة فيما بعد) ، والتي تحتوي على الآلاف من الآبار الدقيقة المصفوفة جيدا والمحاطة بمرايا 45 درجة تسمح بتصوير سريع وثلاثي الأبعاد وعالي الدقة بواسطة الفحص المجهريأحادي الهدف 11. متوافق مع أي مجهر قياسي تجاري مقلوب ، يتيح هذا النظام تصوير 300 مادة عضوية ثلاثية الأبعاد بدقة تحت الخلوية في <1 ساعة.
يبدأ التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا من قالب منظم دقيق موجود ، والذي يحتوي على مئات الأهرامات الدقيقة (الشكل 1 أ) مع قاعدة مربعة وجدران جانبية عند 45 درجة فيما يتعلق بالقاعدة. يوضح الشكل 1C صور المجهر الإلكتروني (EM) لمثل هذه الهياكل. القالب نفسه مصنوع من بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) ويمكن صنعه كنسخة طبق الأصل من قالب أولي (غير موضح هنا) مع الميزات المقابلة (كتجاويف) باستخدام إجراءات الطباعة الحجرية اللينة القياسية. يمكن إنتاج القالب الأساسي بإجراءات مختلفة. تم إجراء البروتوكول المستخدم لهذا البروتوكول باستخدام النقش الرطب السيليكوني كما ورد في Galland et al. 11 ؛ إجراء تصنيع القالب الأساسي ليس بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. يتم ترتيب الأهرامات في مصفوفة مربعة ، مع نفس الملعب لاتجاهات X و Y (في هذه الحالة تكون درجة الصوت 350 ميكرومتر).
على سبيل التوضيح ، تم نشر تجارب إثبات المفهوم12 لإثبات أن الشريحة تسمح بالزراعة طويلة المدى (أشهر) وبروتوكولات التمايز مع تحديد عدد الخلايا الأولية في الآبار بدقة. يمكن مراقبة التطوير الفردي لعدد كبير من الكائنات العضوية تلقائيا على الهواء مباشرة باستخدام مجاهر مضان ساطعة قياسية و 3D ذات صفائح ضوئية. علاوة على ذلك ، يمكن استرجاع المواد العضوية لإجراء مزيد من التحقيقات البيولوجية (على سبيل المثال ، تحليل النسخ). تحدد هذه الورقة البروتوكولات التفصيلية لتصنيع أغطية زراعة الخلايا ، وإجراء البذر والتلوين للفحص المجهري الفلوري ، وكذلك استرجاع المواد العضوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم وصف الإجراء الخاص بتصنيع طبق استزراع البئر الصغير ، والذي يسمح بالثقافة العضوية عالية الكثافة والتمايز ، في هذه الورقة. نظرا لهندسة وترتيب التجاويف الدقيقة ، يمكن استزراع الآلاف من الأجسام الكروية وتلطيخها في لوحة واحدة لفترات طويلة من الزمن (عدة أسابيع أو أكثر) دون أي فقد للمواد تقريب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم البحث من قبل مشروع CALIPSO المدعوم من المؤسسة الوطنية للبحوث ، مكتب رئيس الوزراء ، سنغافورة ، في إطار برنامج الحرم الجامعي للتميز البحثي والمشاريع التكنولوجية (CREATE). يقر V.V. بدعم محقق NRF NRF-NRFI2018-07 ، و MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005 ، والتمويل الأولي MBI ، و ANR ADGastrulo. يقر A.B. و G.G. بالدعم المقدم من التمويل الأساسي ل MBI. A.B. تعترف Andor Technologies بقرض مجهر BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
