Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides
Summary
Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.
Abstract
La caracterización de un gran número de cultivos organotípicos tridimensionales (3D) (organoides) a diferentes escalas de resolución está actualmente limitada por los enfoques de imagen estándar. Este protocolo describe una forma de preparar chips de cultivo de organoides microfabricados, que permiten imágenes en vivo 3D multiescala en un instrumento fácil de usar que requiere manipulaciones mínimas y es capaz de un rendimiento de imágenes de hasta 300 organoides / h. Estos chips de cultivo son compatibles con objetivos de aire e inmersión (aire, agua, aceite y silicona) y una amplia gama de microscopios comunes (por ejemplo, disco giratorio, escáner de punto confocal, campo amplio y campo claro). Además, se pueden utilizar con modalidades de hoja de luz como la tecnología de microscopía de iluminación de un solo objetivo y plano único (SPIM) (soSPIM).
El protocolo descrito aquí da pasos detallados para la preparación de los chips de cultivo microfabricados y el cultivo y tinción de organoides. Solo se requiere un corto período de tiempo para familiarizarse, y los consumibles y equipos se pueden encontrar fácilmente en biolaboratorios normales. Aquí, las capacidades de imágenes 3D se demostrarán solo con microscopios estándar comerciales (por ejemplo, disco giratorio para reconstrucción 3D y microscopía de campo amplio para monitoreo de rutina).
Introduction
En los cultivos celulares 3D organotípicos, en lo sucesivo denominados organoides, las células madre se diferencian y se autoorganizan en estructuras espaciales que comparten fuertes similitudes morfológicas y funcionales con órganos reales. Los organoides ofrecen modelos valiosos para estudiar la biología humana y el desarrollo fuera del cuerpo 1,2,3. Se está desarrollando un número creciente de modelos que imitan el hígado, el cerebro, el riñón, el pulmón y muchos otros órganos 2,4,5. La diferenciación en organoides está dirigida por la adición de factores de crecimiento solubles y una matriz extracelular en una secuencia de tiempo precisa. Sin embargo, en marcado contraste con los órganos, el desarrollo de los organoides es bastante heterogéneo.
Más allá de numerosos desafíos biológicos6,7, los cultivos de organoides también plantean desafíos tecnológicos en términos de métodos de cultivo celular, caracterización de la transcriptómica e imágenes. El desarrollo de órganos in vivo ocurre en un entorno biológico que resulta en una autoorganización altamente estereotipada de los arreglos celulares. Cualquier alteración fenotípica puede ser utilizada como un proxy para diagnosticar un estado enfermo. En contraste, los organoides se desarrollan in vitro en microambientes mínimamente controlados compatibles con las condiciones de cultivo celular, lo que resulta en una gran variabilidad en la ruta de desarrollo y la formación de formas para cada organoide individual.
Un estudio reciente8 demostró que la imagen cuantitativa de la forma de organoides (descriptores fenotípicos) junto con la evaluación de unos pocos marcadores genéticos permite la definición de paisajes de desarrollo fenotípico. Podría decirse que la capacidad de relacionar la diversidad de la expresión genómica en organoides con su comportamiento fenotípico es un paso importante hacia la liberación de todo el potencial de los cultivos organotípicos. Por lo tanto, pide el desarrollo de enfoques de imagen dedicados y de alto contenido que permitan la caracterización de características organoides a escalas subcelulares, multicelulares y organoides completas en 3D 9,10.
Desarrollamos una plataforma versátil de detección de alto contenido (HCS) que permite el cultivo de organoides optimizados (desde células madre embrionarias humanas aisladas [hESCs], células madre pluripotentes inducidas humanas [hIPSC] o células primarias hasta organoides diferenciados, multicelulares y 3D) e imágenes 3D rápidas y no invasivas. Integra un dispositivo de cultivo celular 3D miniaturizado de próxima generación, llamado chip JeWells (el chip en adelante), que contiene miles de micropozos bien dispuestos flanqueados por espejos de 45 ° que permiten obtener imágenes rápidas, 3D y de alta resolución mediante microscopía de hoja de luz de un solo objetivo11. Compatible con cualquier microscopio estándar, comercial e invertido, este sistema permite obtener imágenes de 300 organoides en 3D con resolución subcelular en <1 h.
La microfabricación del dispositivo de cultivo celular parte de un molde microestructurado existente, que contiene cientos de micropirámides (Figura 1A) con una base cuadrada y paredes laterales a 45 ° con respecto a la base. La Figura 1C muestra imágenes de microscopio electrónico (EM) de tales estructuras. El molde en sí está hecho de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) y se puede hacer como una réplica de un molde primario (no se muestra aquí) con las características correspondientes (como cavidades) utilizando procedimientos litográficos blandos estándar. El molde primario puede ser producido por diferentes procedimientos. El utilizado para este protocolo se realizó utilizando grabado húmedo de silicio como se informó en Galland et al. 11; El procedimiento para la fabricación del molde primario no es crítico para este protocolo. Las pirámides están dispuestas en una matriz cuadrada, con el mismo paso para las direcciones X e Y (en este caso el paso es de 350 μm).
Como ilustración, se publicaron experimentos de prueba de concepto12 para demostrar que el chip permite protocolos de cultivo y diferenciación a largo plazo (meses) al tiempo que define con precisión el número de células iniciales en los pozos. El desarrollo individual de un gran número de organoides se puede monitorear automáticamente en vivo utilizando microscopios de fluorescencia estándar de campo claro y de hoja de luz 3D. Además, los organoides se pueden recuperar para realizar más investigaciones biológicas (por ejemplo, análisis transcriptómico). Este documento describe protocolos detallados para la fabricación de los cubreobjetos de cultivo celular, el procedimiento de siembra y tinción para microscopía de fluorescencia, así como la recuperación de los organoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento para la fabricación de la placa de cultivo de micropocillos, que permite el cultivo y diferenciación de organoides de alta densidad, se ha descrito en este documento. Debido a la geometría y disposición de las microcavidades, miles de esferoides pueden ser cultivados y teñidos en una sola placa durante largos períodos de tiempo (varias semanas o más) casi sin pérdida de material. A modo de comparación, un área de 4 mm x 2 mm en la placa de cultivo celular puede contener tantos esferoides como u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación cuenta con el apoyo del proyecto CALIPSO apoyado por la Fundación Nacional de Investigación, Oficina del Primer Ministro, Singapur, bajo su programa Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. reconoce el apoyo del investigador de NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding y ANR ADGastrulo. A.B. y G.G. reconocen el apoyo de la financiación básica de MBI. A.B. agradece a Andor Technologies por el préstamo del microscopio BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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