本文提出了一种新型培养基质的制造方案,每mm2具有数百个微容器,其中可以使用高分辨率显微镜培养和观察类器官。还详细介绍了细胞接种和免疫染色方案。
目前,不同分辨率尺度的大量三维(3D)器官型培养物(类器官)的表征受到标准成像方法的限制。该协议描述了一种制备微加工类器官培养芯片的方法,该方法可在用户友好的仪器上实现多尺度,3D实时成像,需要最少的操作,并且能够达到300个类器官/ h的成像通量。这些培养芯片与空气物镜和浸没物镜(空气、水、油和硅)以及各种常见显微镜(例如转盘、点扫描仪共聚焦、广视场和明场)兼容。此外,它们可以与光片模式一起使用,例如单物镜、单平面照明显微镜(SPIM)技术(soSPIM)。
此处描述的方案给出了制备微加工培养芯片以及类器官培养和染色的详细步骤。只需要很短的时间就可以熟悉,消耗品和设备可以在正常的生物实验室中轻松找到。在这里,3D成像功能将仅使用商业标准显微镜(例如,用于3D重建的转盘和用于常规监测的宽视场显微镜)进行演示。
在器官型3D细胞培养物(以下简称类器官)中,干细胞分化并自组织成与真实器官具有强烈形态和功能相似性的空间结构。类器官为研究人类生物学和体外发育提供了有价值的模型1,2,3。越来越多的模型正在开发中,这些模型可以模仿肝脏,大脑,肾脏,肺和许多其他器官2,4,5。类器官的分化是通过在精确的时间序列中添加可溶性生长因子和细胞外基质来指导的。然而,与器官形成鲜明对比的是,类器官的发育是相当异质的。
除了众多生物学挑战6,7之外,类器官培养在细胞培养方法、转录组学表征和成像方面也带来了技术挑战。体内器官发育发生在生物环境中,导致细胞排列的高度刻板的自组织。任何表型改变都可以用作诊断患病状态的代理。相比之下,类器官在与细胞培养条件兼容的最小受控微环境中体外发育,导致每个个体类器官的发育路径和形状形成存在很大差异。
最近的一项研究8表明,类器官形状(表型描述符)的定量成像与一些遗传标记的评估相结合,可以定义表型发育景观。可以说,将类器官中基因组表达的多样性与其表型行为联系起来的能力是释放器官型培养物全部潜力的重要一步。因此,它乞求开发专用的高内涵成像方法,允许在3D9,10中表征亚细胞,多细胞和全类器官尺度的类器官特征。
我们开发了一种多功能高内涵筛选(HCS)平台,允许简化类器官培养(从分离的人胚胎干细胞[hESCs],人诱导多能干细胞[hIPSC]或原代细胞到3D,多细胞,分化的类器官)和快速,非侵入性的3D成像。它集成了下一代微型化3D细胞培养设备,称为JeWells芯片(以下简称 芯片 ),其中包含数千个排列良好的微孔,两侧是45°镜,可通过单物镜光片显微镜进行快速,3D,高分辨率成像11。该系统与任何标准的商用倒置显微镜兼容,可在 <1 小时内以亚细胞分辨率对 300 个类器官进行 3D 成像。
细胞培养装置的微细加工从现有的微结构模具开始,该模具包含数百个微金字塔(图1A),其方形底座和相对于底座45°的侧壁。 图1C 显示了这种结构的电子显微镜(EM)图像。模具本身由聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)制成,可以使用标准的软光刻程序制成具有相应特征(作为型腔)的主模具(此处未显示)的复制铸件。主模具可以通过不同的程序生产。用于该协议的协议是使用硅湿法蚀刻制成的,如Galland等人所报道的那样。11;主模具的制造程序对于该协议并不重要。金字塔排列成方形阵列,X 和 Y 方向的间距相同(在这种情况下,间距为 350 μm)。
作为例证,发表了概念验证实验12 ,以证明该芯片允许长期培养(数月)和分化方案,同时精确定义孔中初始细胞的数量。使用标准明场和3D光片荧光显微镜可以自动实时监测大量类器官的个体发育。此外,可以检索类器官以进行进一步的生物学研究(例如,转录组学分析)。本文概述了细胞培养盖玻片制造的详细方案、荧光显微镜的接种和染色程序以及类器官的检索。
本文描述了微孔培养皿的制备方法,该培养皿允许高密度类器官培养和分化。由于微腔的几何形状和排列,可以在单个板中长时间(数周或更长时间)培养和染色数千个球体,几乎没有材料损失。相比之下,细胞培养板上4 mm x 2 mm的区域可以包含与单个384孔板一样多的球状体,面积为12 cm x 8 cm。
微腔的规律分布和用作基质的扁平标准盖玻片能够以 3D 方式监测数千个活的或固?…
The authors have nothing to disclose.
该研究得到了新加坡总理办公室国家研究基金会在其卓越研究和技术企业校园(CREATE)计划下支持的CALIPSO项目的支持。V.V.感谢NRF调查员NRF-NRFI2018-07,教育部3级MOE2016-T3-1-005,MBI种子资金和ANR ADGastrulo的支持。A.B.和G.G.感谢MBI核心资金的支持。A.B.感谢Andor Technologies借用BC43显微镜。
2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
DI Milliq water | Millipore | ||
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |