Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden
Summary
Dit artikel presenteert een fabricageprotocol voor een nieuw type kweeksubstraat met honderden microcontainers per mm2, waarin organoïden kunnen worden gekweekt en waargenomen met behulp van microscopie met hoge resolutie. De protocollen voor het zaaien en immunostainen van cellen zijn ook gedetailleerd.
Abstract
De karakterisering van een groot aantal driedimensionale (3D) organotypische culturen (organoïden) op verschillende resolutieschalen wordt momenteel beperkt door standaard beeldvormingsbenaderingen. Dit protocol beschrijft een manier om microgefabriceerde organoïde kweekchips te bereiden, die multiscale, 3D live imaging mogelijk maken op een gebruiksvriendelijk instrument dat minimale manipulaties vereist en in staat is tot 300 organoïden / h imaging-doorvoer. Deze kweekchips zijn compatibel met zowel lucht- als onderdompelingsdoelen (lucht, water, olie en siliconen) en een breed scala aan gangbare microscopen (bijv. Draaiende schijf, puntscanner confocal, breed veld en brightfield). Bovendien kunnen ze worden gebruikt met light-sheet modaliteiten zoals de single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) technologie (soSPIM).
Het hier beschreven protocol geeft gedetailleerde stappen voor de bereiding van de microgefabriceerde kweekchips en de kweek en kleuring van organoïden. Er is slechts een korte tijd nodig om vertrouwd te raken en verbruiksartikelen en apparatuur zijn gemakkelijk te vinden in normale biolabs. Hier zullen de 3D-beeldvormingsmogelijkheden alleen worden gedemonstreerd met commerciële standaardmicroscopen (bijv. Draaiende schijf voor 3D-reconstructie en wide field microscopie voor routinematige monitoring).
Introduction
In organotypische 3D-celculturen, hierna organoïden genoemd, differentiëren stamcellen en organiseren ze zichzelf in ruimtelijke structuren die sterke morfologische en functionele overeenkomsten delen met echte organen. Organoïden bieden waardevolle modellen om de menselijke biologie en ontwikkeling buiten het lichaam te bestuderen 1,2,3. Er wordt een groeiend aantal modellen ontwikkeld die de lever, hersenen, nieren, longen en vele andere organen nabootsen 2,4,5. Differentiatie in organoïden wordt gestuurd door de toevoeging van oplosbare groeifactoren en een extracellulaire matrix in een precieze tijdsvolgorde. In schril contrast met organen is de ontwikkeling van organoïden echter vrij heterogeen.
Naast tal van biologische uitdagingen 6,7, vormen organoïde culturen ook technologische uitdagingen op het gebied van celkweekmethoden, karakterisering van transcriptomica en beeldvorming. In vivo orgaanontwikkeling vindt plaats in een biologische omgeving die resulteert in een zeer stereotiepe zelforganisatie van celarrangementen. Elke fenotypische verandering kan worden gebruikt als een proxy om een zieke toestand te diagnosticeren. Daarentegen ontwikkelen organoïden zich in vitro in minimaal gecontroleerde micro-omgevingen die compatibel zijn met celkweekomstandigheden, wat resulteert in grote variabiliteit in het ontwikkelingspad en de vormvorming voor elke individuele organoïde.
Een recente studie8 toonde aan dat kwantitatieve beeldvorming van organoïde vorm (fenotype descriptoren) gekoppeld aan de beoordeling van een paar genetische markers de definitie van fenotypische ontwikkelingslandschappen mogelijk maakt. Ongetwijfeld is het vermogen om de diversiteit van genomische expressie in organoïden te relateren aan hun fenotypische gedrag een belangrijke stap in de richting van het ontketenen van het volledige potentieel van organotypische culturen. Het smeekt dus om de ontwikkeling van speciale, high-content beeldvormingsbenaderingen die de karakterisering van organoïde kenmerken op subcellulaire, meercellige en geheel-organoïde schalen in 3D 9,10 mogelijk maken.
We ontwikkelden een veelzijdig high-content screening (HCS) platform dat gestroomlijnde organoïde cultuur mogelijk maakt (van geïsoleerde menselijke embryonale stamcellen [hESCs], door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen [hIPSC’s], of primaire cellen naar 3D, meercellige, gedifferentieerde organoïden) en snelle, niet-invasieve 3D-beeldvorming. Het integreert een next-generation, geminiaturiseerd, 3D-celcultuurapparaat, de JeWells-chip (de chip hierna), dat duizenden goed gerangschikte microwells bevat, geflankeerd door 45 ° -spiegels die snelle, 3D-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk maken door single-objective light-sheet microscopie11. Dit systeem is compatibel met elke standaard, commerciële, omgekeerde microscoop en maakt de beeldvorming van 300 organoïden in 3D mogelijk met subcellulaire resolutie in <1 uur.
De microfabricage van het celkweekapparaat vertrekt vanuit een bestaande microgestructureerde mal, die honderden micropyramiden bevat (figuur 1A) met een vierkante basis en zijwanden op 45° ten opzichte van de basis. Figuur 1C toont elektronenmicroscoop (EM) beelden van dergelijke structuren. De mal zelf is gemaakt van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) en kan worden gemaakt als een replica gegoten van een primaire mal (hier niet weergegeven) met overeenkomstige kenmerken (als holtes) met behulp van standaard soft-lithografische procedures. De primaire mal kan door verschillende procedures worden geproduceerd. Degene die voor dit protocol werd gebruikt, werd gemaakt met behulp van silicium nat etsen zoals gerapporteerd in Galland et al. 11; de procedure voor de fabricage van de primaire mal is niet van cruciaal belang voor dit protocol. De piramides zijn gerangschikt in een vierkante array, met dezelfde toonhoogte voor de X- en Y-richting (in dit geval is de toonhoogte 350 μm).
Ter illustratie werden proof-of-concept experimenten12 gepubliceerd om aan te tonen dat de chip langdurige kweek (maanden) en differentiatieprotocollen mogelijk maakt, terwijl het aantal initiële cellen in de putten nauwkeurig wordt gedefinieerd. De individuele ontwikkeling van een groot aantal organoïden kan automatisch live worden gevolgd met behulp van standaard brightfield- en 3D-lichtplaatfluorescentiemicroscopen. Bovendien kunnen organoïden worden opgehaald om verder biologisch onderzoek uit te voeren (bijv. transcriptomische analyse). Dit artikel schetst gedetailleerde protocollen voor de fabricage van de celkweek coverslips, de zaai- en kleuringsprocedure voor fluorescentiemicroscopie, evenals het ophalen van de organoïden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De procedure voor de fabricage van de microwellcultuurschaal, die organoïde cultuur en differentiatie met hoge dichtheid mogelijk maakt, is in dit artikel beschreven. Dankzij de geometrie en rangschikking van de microcaviteiten kunnen duizenden sferoïden gedurende lange tijd (enkele weken of langer) in een enkele plaat worden gekweekt en gekleurd met bijna geen verlies van materiaal. Ter vergelijking: een gebied van 4 mm x 2 mm op de celkweekplaat kan evenveel sferoïden bevatten als een enkele 384-well plaat met een o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek wordt ondersteund door het CALIPSO-project dat wordt ondersteund door de National Research Foundation, Prime Minister’s Office, Singapore, in het kader van het Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -programma. V.V. erkent de steun van NRF-onderzoeker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding en ANR ADGastrulo. A.B. en G.G. erkennen de steun van de MBI-kernfinanciering. A.B. erkent Andor Technologies voor de bruikleen van de BC43 microscoop.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
