Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform
Summary
Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.
Abstract
Çok sayıda üç boyutlu (3D) organotipik kültürün (organoid) farklı çözünürlük ölçeklerinde karakterizasyonu günümüzde standart görüntüleme yaklaşımları ile sınırlıdır. Bu protokol, minimum manipülasyon gerektiren ve 300 organoid / s’ye kadar görüntüleme verimi yapabilen kullanıcı dostu bir cihazda çok ölçekli, 3D canlı görüntülemeye olanak tanıyan mikrofabrikasyonlu organoid kültür çipleri hazırlamanın bir yolunu açıklar. Bu kültür çipleri hem hava hem de daldırma hedefleriyle (hava, su, yağ ve silikon) ve çok çeşitli yaygın mikroskoplarla (örneğin, dönen disk, nokta tarayıcı konfokal, geniş alan ve parlak alan) uyumludur. Ayrıca, tek amaçlı, tek düzlemli aydınlatma mikroskobu (SPIM) teknolojisi (soSPIM) gibi ışık tabakası modaliteleri ile kullanılabilirler.
Burada açıklanan protokol, mikrofabrikasyon kültür çiplerinin hazırlanması ve organoidlerin kültürü ve boyanması için ayrıntılı adımlar vermektedir. Aşina olmak için sadece kısa bir süre gerekir ve sarf malzemeleri ve ekipmanlar normal biyolablarda kolayca bulunabilir. Burada, 3D görüntüleme yetenekleri yalnızca ticari standart mikroskoplarla gösterilecektir (örneğin, 3D rekonstrüksiyon için dönen disk ve rutin izleme için geniş alan mikroskobu).
Introduction
Bundan böyle organoidler olarak adlandırılacak olan organotipik 3B hücre kültürlerinde, kök hücreler farklılaşır ve gerçek organlarla güçlü morfolojik ve fonksiyonel benzerlikler paylaşan mekansal yapılara kendi kendini organize eder. Organoidler, insan biyolojisini ve vücut dışındaki gelişimini incelemek için değerli modeller sunar 1,2,3. Karaciğeri, beyni, böbreği, akciğeri ve diğer birçok organı taklit eden giderek artan sayıda model geliştirilmektedir 2,4,5. Organoidlerde farklılaşma, çözünür büyüme faktörlerinin ve hücre dışı bir matrisin kesin bir zaman dizisine eklenmesiyle yönlendirilir. Bununla birlikte, organların belirgin aksine, organoidlerin gelişimi oldukça heterojendir.
Çok sayıdabiyolojik zorluğun 6,7 ötesinde, organoid kültürler hücre kültürü yöntemleri, transkriptomiklerin karakterizasyonu ve görüntüleme açısından teknolojik zorluklar da ortaya koymaktadır. İn vivo organ gelişimi, hücre düzenlemelerinin oldukça basmakalıp bir şekilde kendi kendine organizasyonu ile sonuçlanan biyolojik bir ortamda meydana gelir. Herhangi bir fenotipik değişiklik, hastalıklı bir durumu teşhis etmek için bir vekil olarak kullanılabilir. Buna karşılık, organoidler, hücre kültürü koşullarıyla uyumlu, minimal kontrollü mikro ortamlarda in vitro olarak gelişir ve bu da her bir organoid için gelişim yolunda ve şekil oluşumunda büyük değişkenliğe neden olur.
Yakın zamanda yapılan bir çalışma8, organoid şeklin (fenotip tanımlayıcıları) kantitatif görüntülenmesinin, birkaç genetik belirtecin değerlendirilmesine bağlı olarak, fenotipik gelişim manzaralarının tanımlanmasına izin verdiğini göstermiştir. Muhtemelen, organoidlerdeki genomik ekspresyon çeşitliliğini fenotipik davranışlarıyla ilişkilendirme yeteneği, organotipik kültürlerin tüm potansiyelini açığa çıkarmaya yönelik önemli bir adımdır. Bu nedenle, 3D 9,10’da hücre altı, çok hücreli ve tüm organoid ölçeklerde organoid özelliklerin karakterizasyonuna izin veren özel, yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi için yalvarmaktadır.
Aerodinamik organoid kültürüne (izole insan embriyonik kök hücrelerinden [hESC’ler], insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden [hIPSC’ler] veya birincil hücrelerden 3D, çok hücreli, farklılaştırılmış organoidlere) ve hızlı, invaziv olmayan 3D görüntülemeye izin veren çok yönlü bir yüksek içerikli tarama (HCS) platformu geliştirdik. JeWells çipi (bundan böyle çip olarak anılacaktır) adı verilen yeni nesil, minyatürleştirilmiş, 3D hücre kültürü cihazını entegre eder ve tek nesneli ışık tabakası mikroskobu11 ile hızlı, 3D, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin veren 45 ° aynalarla çevrili binlerce iyi dizilmiş mikro kuyu içerir. Herhangi bir standart, ticari, ters çevrilmiş mikroskopla uyumlu olan bu sistem, 300 organoidin <1 saatte hücre altı çözünürlükle 3D olarak görüntülenmesini sağlar.
Hücre kültürü cihazının mikrofabrikasyonu, tabana göre kare tabanlı ve 45 ° ‘de yan duvarlara sahip yüzlerce mikropiramit (Şekil 1A) içeren mevcut bir mikro yapılandırılmış kalıptan başlar. Şekil 1C, bu tür yapıların elektron mikroskobu (EM) görüntülerini göstermektedir. Kalıbın kendisi poli(dimetilsiloksan) (PDMS) ‘den yapılmıştır ve standart yumuşak-litografik prosedürler kullanılarak karşılık gelen özelliklere (boşluklar olarak) sahip bir birincil kalıbın (burada gösterilmeyen) bir kopyası olarak yapılabilir. Birincil kalıp farklı prosedürlerle üretilebilir. Bu protokol için kullanılan, Galland ve ark.’da bildirildiği gibi silikon ıslak aşındırma kullanılarak yapılmıştır. 11; birincil kalıbın imalat prosedürü bu protokol için kritik değildir. Piramitler, X ve Y yönleri için aynı perdeye sahip kare bir dizide düzenlenmiştir (bu durumda perde 350 μm’dir).
Örnek olarak, çipin kuyulardaki ilk hücrelerin sayısını tam olarak tanımlarken uzun vadeli kültür (aylar) ve farklılaşma protokollerine izin verdiğini göstermek için kavram kanıtı deneyleri12 yayınlandı. Çok sayıda organoidin bireysel gelişimi, standart parlak alan ve 3D ışık tabakası floresan mikroskopları kullanılarak canlı olarak otomatik olarak izlenebilir. Ayrıca, organoidler daha ileri biyolojik araştırmalar yapmak için alınabilir (örneğin, transkriptomik analiz). Bu makale, hücre kültürü kapaklarının üretimi, floresan mikroskobu için tohumlama ve boyama prosedürü ve organoidlerin geri alınması için ayrıntılı protokolleri özetlemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yüksek yoğunluklu organoid kültür ve farklılaşmaya izin veren mikrowell kültür kabının üretim prosedürü bu makalede açıklanmıştır. Mikro boşlukların geometrisi ve düzenlenmesi sayesinde, binlerce sferoid, neredeyse hiç malzeme kaybı olmadan uzun süre (birkaç hafta veya daha fazla) tek bir plakada kültürlenebilir ve boyanabilir. Bir karşılaştırma olarak, hücre kültürü plakasındaki 4 mm x 2 mm’lik bir alan, 12 cm x 8 cm’lik bir alana sahip tek bir 384 kuyucuklu plaka kadar sferoid içere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma, Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakanlık Ofisi, Singapur tarafından desteklenen CALIPSO projesi tarafından, Araştırma Mükemmelliği ve Teknolojik Girişim Kampüsü (CREATE) programı kapsamında desteklenmektedir. V.V., NMK araştırmacısı NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI tohum finansmanı ve ANR ADGastrulo’nun desteğini kabul eder. A.B. ve G.G., MBI’nın çekirdek finansmanından gelen desteği kabul ediyor. A.B., Andor Technologies’i BC43 mikroskobunun ödünç verilmesi için kabul etti.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
