ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म
Summary
यह पेपर प्रति मिमी2 सैकड़ों माइक्रोकंटेनर्स के साथ एक नए प्रकार के कल्चर सब्सट्रेट के लिए एक निर्माण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें ऑर्गेनोइड्स को उच्च-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सुसंस्कृत और देखा जा सकता है। सेल सीडिंग और इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल भी विस्तृत हैं।
Abstract
विभिन्न रिज़ॉल्यूशन स्केल पर बड़ी संख्या में त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों (ऑर्गेनोइड्स) का लक्षण वर्णन वर्तमान में मानक इमेजिंग दृष्टिकोणों द्वारा सीमित है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोफैब्रिकेटेड ऑर्गेनॉइड कल्चर चिप्स तैयार करने के एक तरीके का वर्णन करता है, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण पर मल्टीस्केल, 3 डी लाइव इमेजिंग को सक्षम करता है जिसमें न्यूनतम जोड़तोड़ की आवश्यकता होती है और 300 ऑर्गेनोइड / एच इमेजिंग थ्रूपुट तक सक्षम होता है। ये संस्कृति चिप्स हवा और विसर्जन उद्देश्यों (हवा, पानी, तेल और सिलिकॉन) और सामान्य माइक्रोस्कोप की एक विस्तृत श्रृंखला (जैसे, स्पिनिंग डिस्क, पॉइंट स्कैनर कॉन्फोकल, वाइड फील्ड और ब्राइटफील्ड) दोनों के साथ संगत हैं। इसके अलावा, उनका उपयोग लाइट-शीट तौर-तरीकों जैसे एकल-उद्देश्य, एकल-विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम) प्रौद्योगिकी (एसओएसपीआईएम) के साथ किया जा सकता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल माइक्रोफैब्रिकेटेड कल्चर चिप्स की तैयारी और ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और धुंधलापन के लिए विस्तृत कदम देता है। परिचित होने के लिए केवल थोड़े समय की आवश्यकता होती है, और उपभोग्य सामग्री और उपकरण आसानी से सामान्य बायोलैब्स में पाए जा सकते हैं। यहां, 3 डी इमेजिंग क्षमताओं को केवल वाणिज्यिक मानक माइक्रोस्कोप (उदाहरण के लिए, 3 डी पुनर्निर्माण के लिए स्पिनिंग डिस्क और नियमित निगरानी के लिए व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी) के साथ प्रदर्शित किया जाएगा।
Introduction
ऑर्गेनोटाइपिक 3 डी सेल संस्कृतियों में, इसके बाद ऑर्गेनोइड्स के रूप में जाना जाता है, स्टेम सेल स्थानिक संरचनाओं में अंतर और आत्म-व्यवस्थित होते हैं जो वास्तविक अंगों के साथ मजबूत रूपात्मक और कार्यात्मक समानताएं साझा करते हैं। ऑर्गेनोइड्स शरीर के बाहर मानव जीव विज्ञान और विकास का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं 1,2,3. मॉडलों की बढ़ती संख्या विकसित की जा रही है जो यकृत, मस्तिष्क, गुर्दे, फेफड़े और कई अन्यअंगों 2,4,5 की नकल करते हैं। ऑर्गेनोइड्स में भेदभाव एक सटीक समय अनुक्रम में घुलनशील विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स के अतिरिक्त निर्देशित होता है। हालांकि, अंगों के विपरीत, ऑर्गेनोइड्स का विकास काफी विषम है।
कई जैविक चुनौतियों 6,7 से परे, ऑर्गेनोइड संस्कृतियां सेल संस्कृति विधियों, ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स के लक्षण वर्णन और इमेजिंग के संदर्भ में तकनीकी चुनौतियां भी पैदा करती हैं। विवो अंग विकास एक जैविक वातावरण में होता है जिसके परिणामस्वरूप सेल व्यवस्था का अत्यधिक रूढ़िवादी स्व-संगठन होता है। किसी भी फेनोटाइपिक परिवर्तन का उपयोग रोगग्रस्त स्थिति का निदान करने के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता है। इसके विपरीत, ऑर्गेनोइड्स सेल कल्चर स्थितियों के साथ संगत न्यूनतम नियंत्रित माइक्रोएन्वायरमेंट में विट्रो में विकसित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक व्यक्तिगत ऑर्गेनॉइड के लिए विकास पथ और आकार गठन में बड़ी परिवर्तनशीलता होती है।
हाल के एक अध्ययन8 से पता चला है कि कुछ आनुवंशिक मार्करों के मूल्यांकन के साथ युग्मित ऑर्गेनॉइड आकार (फेनोटाइप डिस्क्रिप्टर) की मात्रात्मक इमेजिंग फेनोटाइपिक विकास परिदृश्य की परिभाषा की अनुमति देती है। यकीनन, ऑर्गेनोइड्स में जीनोमिक अभिव्यक्ति की विविधता को उनके फेनोटाइपिक व्यवहार के साथ संबंधित करने की क्षमता ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों की पूरी क्षमता को उजागर करने की दिशा में एक बड़ा कदम है। इस प्रकार, यह समर्पित, उच्च-सामग्री इमेजिंग दृष्टिकोण के विकास के लिए भीख मांगता है जो 3 डी 9,10 में उपकोशिकीय, बहुकोशिकीय और पूरे-ऑर्गेनोइड तराजू पर ऑर्गेनोइड सुविधाओं के लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।
हमने एक बहुमुखी उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच विकसित किया है जो सुव्यवस्थित ऑर्गेनोइड संस्कृति (पृथक मानव भ्रूण स्टेम सेल [एचईएससी], मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल [एचआईपीएससी], या प्राथमिक कोशिकाओं से 3 डी, बहुकोशिकीय, विभेदित ऑर्गेनोइड्स) और तेज, गैर-इनवेसिव 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है। यह अगली पीढ़ी के, लघु, 3 डी सेल कल्चर डिवाइस को एकीकृत करता है, जिसे जेवेल्स चिप (इसके बाद चिप ) कहा जाता है, जिसमें 45 डिग्री दर्पण के साथ हजारों अच्छी तरह से सरणी वाले माइक्रोवेल होते हैं जो एकल-उद्देश्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी11 द्वारा तेज, 3 डी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की अनुमति देते हैं। किसी भी मानक, वाणिज्यिक, उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ संगत, यह प्रणाली <1 घंटे में उपकोशिकीय संकल्प के साथ 3 डी में 300 ऑर्गेनोइड्स की इमेजिंग को सक्षम बनाती है।
सेल कल्चर डिवाइस का माइक्रोफैब्रिकेशन एक मौजूदा माइक्रोस्ट्रक्चर्ड मोल्ड से शुरू होता है, जिसमें बेस के संबंध में एक वर्ग आधार और 45 डिग्री पर साइडवॉल के साथ सैकड़ों माइक्रोमाइरामिड (चित्रा 1 ए) होते हैं। चित्रा 1 सी ऐसी संरचनाओं के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ईएम) छवियों को दर्शाता है। मोल्ड स्वयं पॉली (डाइमिथाइलसिलोक्सेन) (पीडीएमएस) से बना है और मानक नरम-लिथोग्राफिक प्रक्रियाओं का उपयोग करके संबंधित विशेषताओं (गुहाओं के रूप में) के साथ एक प्राथमिक मोल्ड (यहां नहीं दिखाया गया है) की प्रतिकृति कास्ट के रूप में बनाया जा सकता है। प्राथमिक मोल्ड विभिन्न प्रक्रियाओं द्वारा उत्पादित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया सिलिकॉन गीली नक़्क़ाशी का उपयोग करके बनाया गया था जैसा कि गैलैंड एट अल में बताया गया है। 11; प्राथमिक मोल्ड के निर्माण की प्रक्रिया इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। पिरामिड को एक वर्ग सरणी में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें एक्स और वाई दिशाओं के लिए एक ही पिच होती है (इस मामले में पिच 350 μm है)।
एक उदाहरण के रूप में, प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट प्रयोग12 को यह प्रदर्शित करने के लिए प्रकाशित किया गया था कि चिप कुओं में प्रारंभिक कोशिकाओं की संख्या को सटीक रूप से परिभाषित करते हुए दीर्घकालिक संस्कृति (महीनों) और भेदभाव प्रोटोकॉल की अनुमति देता है। मानक ब्राइटफील्ड और 3 डी लाइट-शीट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स के व्यक्तिगत विकास की स्वचालित रूप से लाइव निगरानी की जा सकती है। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड्स को आगे की जैविक जांच (जैसे, ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण) करने के लिए पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। यह पेपर सेल कल्चर कवरलिप्स के निर्माण, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए सीडिंग और धुंधला प्रक्रिया के साथ-साथ ऑर्गेनोइड्स की पुनर्प्राप्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोवेल कल्चर डिश के निर्माण की प्रक्रिया, जो उच्च घनत्व वाले ऑर्गेनोइड संस्कृति और भेदभाव की अनुमति देती है, इस पेपर में वर्णित की गई है। माइक्रोकैविटीज़ की ज्यामिति और व्यवस्था के कारण, हजारों स्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुसंधान को नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, प्रधान मंत्री कार्यालय, सिंगापुर द्वारा समर्थित कैलिप्सो परियोजना द्वारा समर्थित किया गया है, जो अपने कैंपस फॉर रिसर्च एक्सीलेंस एंड टेक्नोलॉजिकल एंटरप्राइज (क्रिएट) कार्यक्रम के तहत है। वी.वी. एनआरएफ अन्वेषक एनआरएफ-एनआरएफआई 2018-07, एमओई टियर 3 एमओई 2016-टी 3-1-005, एमबीआई बीज वित्तपोषण और एएनआर एडीजीस्ट्रुलो के समर्थन को स्वीकार करता है। एबी और जीजी एमबीआई कोर फंडिंग से समर्थन स्वीकार करते हैं। एबी बीसी 43 माइक्रोस्कोप के ऋण के लिए एंडोर टेक्नोलॉजीज को स्वीकार करता है।
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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