En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider
Summary
Dette papiret presenterer en fabrikasjonsprotokoll for en ny type kultursubstrat med hundrevis av mikrobeholdere per mm2, hvor organoider kan dyrkes og observeres ved hjelp av høyoppløselig mikroskopi. Cellesåings- og immunfargingsprotokollene er også detaljerte.
Abstract
Karakteriseringen av et stort antall tredimensjonale (3D) organotypiske kulturer (organoider) på forskjellige oppløsningsskalaer er for tiden begrenset av standard bildebehandlingsmetoder. Denne protokollen beskriver en måte å forberede mikrofabrikerte organoidkulturbrikker på, som muliggjør multiskala, 3D-live-bildebehandling på et brukervennlig instrument som krever minimal manipulasjon og er i stand til opptil 300 organoider/t-bildegjennomstrømning. Disse kulturbrikkene er kompatible med både luft- og nedsenkningsmål (luft, vann, olje og silikon) og et bredt spekter av vanlige mikroskoper (f.eks. spinnskive, punktskanner konfokal, bredt felt og brightfield). Videre kan de brukes med lysarkmodaliteter som single-objective, single-plane illumination microscopy (SPIM) teknologi (soSPIM).
Protokollen beskrevet her gir detaljerte trinn for fremstilling av mikrofabrikerte kulturbrikker og kultur og farging av organoider. Bare kort tid er nødvendig for å bli kjent med, og forbruksvarer og utstyr kan lett finnes i vanlige biolaboratorier. Her vil 3D-bildebehandlingsmulighetene kun bli demonstrert med kommersielle standardmikroskoper (f.eks. Spinning disk for 3D-rekonstruksjon og bredfeltsmikroskopi for rutinemessig overvåking).
Introduction
I organotypiske 3D-cellekulturer, heretter kalt organoider, differensierer og organiserer stamceller seg til romlige strukturer som deler sterke morfologiske og funksjonelle likheter med virkelige organer. Organoider tilbyr verdifulle modeller for å studere menneskelig biologi og utvikling utenfor kroppen 1,2,3. Et økende antall modeller utvikles som etterligner leveren, hjernen, nyren, lungen og mange andre organer 2,4,5. Differensiering i organoider styres ved tilsetning av løselige vekstfaktorer og en ekstracellulær matrise i en presis tidssekvens. Men i markert kontrast til organer er utviklingen av organoider ganske heterogen.
Utover mange biologiske utfordringer6,7, utgjør organoidkulturer også teknologiske utfordringer når det gjelder cellekulturmetoder, karakterisering av transkriptomikk og avbildning. In vivo organutvikling skjer i et biologisk miljø som resulterer i en svært stereotyp selvorganisering av cellearrangementer. Enhver fenotypisk endring kan brukes som en proxy for å diagnostisere en syk tilstand. I motsetning til dette utvikler organoider in vitro i minimalt kontrollerte mikromiljøer som er kompatible med cellekulturforhold, noe som resulterer i stor variasjon i utviklingsbanen og formdannelsen for hver enkelt organoid.
En nylig studie8 viste at kvantitativ avbildning av organoid form (fenotypebeskrivelser) kombinert med vurderingen av noen få genetiske markører tillater definisjonen av fenotypiske utviklingslandskap. Uten tvil er evnen til å relatere mangfoldet av genomisk uttrykk i organoider med deres fenotypiske oppførsel et stort skritt mot å frigjøre det fulle potensialet til organotypiske kulturer. Dermed ber det om utvikling av dedikerte bildebehandlingsmetoder med høyt innhold som tillater karakterisering av organoide egenskaper på subcellulære, flercellede og helorganoide skalaer i 3D 9,10.
Vi utviklet en allsidig screeningplattform med høyt innhold (HCS) som muliggjør strømlinjeformet organoidkultur (fra isolerte humane embryonale stamceller [hESC], humaninduserte pluripotente stamceller [hIPSC] eller primære celler til 3D, flercellede, differensierte organoider) og rask, ikke-invasiv 3D-avbildning. Den integrerer en neste generasjons, miniatyrisert, 3D-cellekulturenhet, kalt JeWells-brikken ( brikken heretter), som inneholder tusenvis av godt arrangerte mikrobrønner flankert med 45 ° speil som tillater rask, 3D, høyoppløselig avbildning ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi11. Kompatibelt med ethvert standard, kommersielt, invertert mikroskop, muliggjør dette systemet avbildning av 300 organoider i 3D med subcellulær oppløsning på <1 time.
Mikrofabrikasjonen av cellekulturenheten starter fra en eksisterende mikrostrukturert form, som inneholder hundrevis av mikropyramider (figur 1A) med en firkantet base og sidevegger ved 45 ° i forhold til basen. Figur 1C viser elektronmikroskopbilder (EM) av slike strukturer. Formen i seg selv er laget av poly (dimetylsiloksan) (PDMS) og kan gjøres som en kopi av en primær mold (ikke vist her) med tilsvarende funksjoner (som hulrom) ved hjelp av standard myk-litografiske prosedyrer. Den primære formen kan produseres ved forskjellige prosedyrer. Den som ble brukt til denne protokollen ble laget ved hjelp av silisium våt etsing som rapportert i Galland et al. 11; Prosedyren for fremstilling av primærformen er ikke kritisk for denne protokollen. Pyramidene er ordnet i en kvadratisk matrise, med samme tonehøyde for X- og Y-retningene (i dette tilfellet er tonehøyden 350 μm).
Som en illustrasjon ble proof-of-concept-eksperimenter12 publisert for å demonstrere at brikken tillater langsiktig kultur (måneder) og differensieringsprotokoller mens den nøyaktig definerer antall innledende celler i brønnene. Individuell utvikling av et stort antall organoider kan automatisk overvåkes live ved hjelp av standard lysfelt og 3D lysarkfluorescensmikroskoper. Videre kan organoider hentes for å utføre ytterligere biologiske undersøkelser (f.eks. Transkriptomisk analyse). Dette papiret skisserer detaljerte protokoller for fremstilling av cellekulturdekselene, såings- og fargeprosedyren for fluorescensmikroskopi, samt gjenfinning av organoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prosedyren for fremstilling av mikrobrønnkulturskålen, som tillater organoidkultur og differensiering med høy tetthet, er beskrevet i dette papiret. På grunn av geometrien og arrangementet av mikrohulrommene, kan tusenvis av sfæroider dyrkes og farges i en enkelt plate i lange perioder (flere uker eller mer) med nesten ingen tap av materiale. Til sammenligning kan et område på 4 mm x 2 mm på cellekulturplaten inneholde så mange sfæroider som en enkelt 384-brønnplate med et areal på 12 cm x 8 cm.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen støttes av CALIPSO-prosjektet støttet av National Research Foundation, Prime Minister’s Office, Singapore, under sitt Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) -program. VV anerkjenner støtten fra NRF-etterforsker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-frøfinansiering og ANR ADGastrulo. AB og GG anerkjenner støtten fra MBIs kjernefinansiering. AB anerkjenner Andor Technologies for lån av BC43 mikroskop.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
