En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider
Summary
Detta dokument presenterar ett tillverkningsprotokoll för en ny typ av odlingssubstrat med hundratals mikrobehållare per mm2, där organoider kan odlas och observeras med hjälp av högupplöst mikroskopi. Cellsådd- och immunfärgningsprotokollen är också detaljerade.
Abstract
Karakteriseringen av ett stort antal tredimensionella (3D) organotypiska kulturer (organoider) vid olika upplösningsskalor begränsas för närvarande av standardavbildningsmetoder. Detta protokoll beskriver ett sätt att förbereda mikrofabricerade organoidodlingschips, som möjliggör multiskalig, 3D-liveavbildning på ett användarvänligt instrument som kräver minimala manipulationer och kan upp till 300 organoider / h-bildgenomströmning. Dessa odlingschips är kompatibla med både luft- och nedsänkningsmål (luft, vatten, olja och silikon) och ett brett spektrum av vanliga mikroskop (t.ex. spinnskiva, punktskannerkonfokal, brett fält och ljusfält). Dessutom kan de användas med ljusarkmodaliteter som SPIM-tekniken (single-objective, single-plane illumination microscopy) (soSPIM).
Protokollet som beskrivs här ger detaljerade steg för framställning av mikrofabricerade odlingschips och odling och färgning av organoider. Endast en kort tid krävs för att bli bekant med, och förbrukningsvaror och utrustning kan lätt hittas i vanliga biolaboratorier. Här kommer 3D-avbildningsfunktionerna endast att demonstreras med kommersiella standardmikroskop (t.ex. spinnskiva för 3D-rekonstruktion och bredfältsmikroskopi för rutinövervakning).
Introduction
I organotypiska 3D-cellkulturer, nedan kallade organoider, differentierar stamceller och självorganiserar sig i rumsliga strukturer som delar starka morfologiska och funktionella likheter med verkliga organ. Organoider erbjuder värdefulla modeller för att studera mänsklig biologi och utveckling utanför kroppen 1,2,3. Ett växande antal modeller utvecklas som efterliknar lever, hjärna, njure, lunga och många andra organ 2,4,5. Differentiering i organoider styrs genom tillsats av lösliga tillväxtfaktorer och en extracellulär matris i en exakt tidssekvens. Men i markant kontrast till organ är utvecklingen av organoider ganska heterogen.
Utöver många biologiska utmaningar 6,7 utgör organoidkulturer också tekniska utmaningar när det gäller cellodlingsmetoder, karakterisering av transkriptomik och avbildning. In vivo organutveckling sker i en biologisk miljö som resulterar i en mycket stereotyp självorganisation av cellarrangemang. Varje fenotypisk förändring kan användas som en proxy för att diagnostisera ett sjukt tillstånd. Däremot utvecklas organoider in vitro i minimalt kontrollerade mikromiljöer som är kompatibla med cellodlingsförhållanden, vilket resulterar i stor variation i utvecklingsvägen och formbildningen för varje enskild organoid.
En nyligen genomförd studie8 visade att kvantitativ avbildning av organoidform (fenotypdeskriptorer) i kombination med bedömningen av några genetiska markörer möjliggör definition av fenotypiska utvecklingslandskap. Förmodligen är förmågan att relatera mångfalden av genomiskt uttryck i organoider med deras fenotypiska beteende ett stort steg mot att frigöra den fulla potentialen hos organotypiska kulturer. Således ber det om utveckling av dedikerade, höginnehållsavbildningsmetoder som möjliggör karakterisering av organoida egenskaper på subcellulära, flercelliga och helorganoidskalor i 3D 9,10.
Vi utvecklade en mångsidig plattform för screening med högt innehåll (HCS) som möjliggör strömlinjeformad organoidodling (från isolerade mänskliga embryonala stamceller [hESC], humant inducerade pluripotenta stamceller [hIPSC] eller primära celler till 3D, flercelliga, differentierade organoider) och snabb, icke-invasiv 3D-avbildning. Den integrerar en nästa generation, miniatyriserad, 3D-cellodlingsenhet, kallad JeWells-chipet ( chipet nedan), som innehåller tusentals välordnade mikrobrunnar flankerade med 45 ° speglar som möjliggör snabb, 3D, högupplöst avbildning med enkelobjektiv ljusarkmikroskopi11. Detta system är kompatibelt med alla vanliga, kommersiella, inverterade mikroskop och möjliggör avbildning av 300 organoider i 3D med subcellulär upplösning på <1 timmar.
Mikrofabrikationen av cellodlingsanordningen utgår från en befintlig mikrostrukturerad form, som innehåller hundratals mikropyramider (figur 1A) med en kvadratisk bas och sidoväggar vid 45° i förhållande till basen. Figur 1C visar elektronmikroskopbilder (EM) av sådana strukturer. Formen i sig är gjord av poly (dimetylsiloxan) (PDMS) och kan tillverkas som en replikavgjutning av en primär form (visas inte här) med motsvarande egenskaper (som hålrum) med hjälp av standard mjuklitografiska procedurer. Den primära formen kan framställas genom olika förfaranden. Den som användes för detta protokoll gjordes med användning av kiselvåtetsning som rapporterats i Galland et al. 11; Förfarandet för tillverkning av den primära formen är inte kritisk för detta protokoll. Pyramiderna är ordnade i en kvadratisk matris, med samma tonhöjd för X- och Y-riktningarna (i detta fall är tonhöjden 350 μm).
Som en illustration publicerades proof-of-concept-experiment12 för att visa att chipet möjliggör långsiktig odling (månader) och differentieringsprotokoll samtidigt som antalet initiala celler i brunnarna exakt definieras. Individuell utveckling av ett stort antal organoider kan automatiskt övervakas live med hjälp av standard ljusfält och 3D-ljusarkfluorescensmikroskop. Dessutom kan organoider hämtas för att utföra ytterligare biologiska undersökningar (t.ex. transkriptomisk analys). Detta dokument beskriver detaljerade protokoll för tillverkning av cellkulturens täckglas, sådd- och färgningsproceduren för fluorescensmikroskopi samt hämtning av organoiderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förfarandet för tillverkning av mikrobrunnsodlingsskålen, som möjliggör organoidkultur och differentiering med hög densitet, har beskrivits i detta dokument. På grund av mikrokaviteternas geometri och arrangemang kan tusentals sfäroider odlas och färgas i en enda platta under långa perioder (flera veckor eller mer) med nästan ingen förlust av material. Som jämförelse kan ett område på 4 mm x 2 mm på cellodlingsplattan innehålla lika många sfäroider som en enda 384-brunnsplatta med en yta på 12 cm x 8…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen stöds av CALIPSO-projektet som stöds av National Research Foundation, premiärministerns kontor, Singapore, under sitt program Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. erkänner stödet från NRF-utredaren NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-såddfinansiering och ANR ADGastrulo. A.B. och G.G. erkänner stödet från MBI:s kärnfinansiering. A.B. erkänner Andor Technologies för lånet av BC43-mikroskopet.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
