Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes
Summary
Cet article présente un protocole de fabrication pour un nouveau type de substrat de culture avec des centaines de microconteneurs par mm2, dans lequel les organoïdes peuvent être cultivés et observés à l’aide de la microscopie à haute résolution. Les protocoles d’ensemencement cellulaire et d’immunomarquage sont également détaillés.
Abstract
La caractérisation d’un grand nombre de cultures organotypiques tridimensionnelles (3D) (organoïdes) à différentes échelles de résolution est actuellement limitée par les approches d’imagerie standard. Ce protocole décrit un moyen de préparer des puces de culture organoïde microfabriquées, qui permettent une imagerie 3D en direct multi-échelle sur un instrument convivial nécessitant un minimum de manipulations et capable d’atteindre un débit d’imagerie allant jusqu’à 300 organoïdes / h. Ces puces de culture sont compatibles avec les objectifs d’air et d’immersion (air, eau, huile et silicone) et une large gamme de microscopes courants (par exemple, disque rotatif, scanner de point confocale, grand champ et fond clair). De plus, ils peuvent être utilisés avec des modalités de feuille de lumière telles que la technologie de microscopie à objectif unique et à plan unique (SPIM) (soSPIM).
Le protocole décrit ici donne des étapes détaillées pour la préparation des copeaux de culture microfabriqués et la culture et la coloration des organoïdes. Il ne faut que peu de temps pour se familiariser avec et les consommables et l’équipement peuvent être facilement trouvés dans les laboratoires biologiques normaux. Ici, les capacités d’imagerie 3D ne seront démontrées qu’avec des microscopes standard commerciaux (par exemple, disque rotatif pour la reconstruction 3D et microscopie à grand champ pour la surveillance de routine).
Introduction
Dans les cultures de cellules organotypiques 3D, ci-après appelées organoïdes, les cellules souches se différencient et s’auto-organisent en structures spatiales qui partagent de fortes similitudes morphologiques et fonctionnelles avec des organes réels. Les organoïdes offrent des modèles précieux pour étudier la biologie humaine et le développement en dehors du corps 1,2,3. Un nombre croissant de modèles imitant le foie, le cerveau, les reins, les poumons et de nombreux autres organessont en cours de développement 2,4,5. La différenciation dans les organoïdes est dirigée par l’ajout de facteurs de croissance solubles et d’une matrice extracellulaire dans une séquence temporelle précise. Cependant, contrairement aux organes, le développement des organoïdes est assez hétérogène.
Au-delà des nombreux défis biologiques6,7, les cultures organoïdes posent également des défis technologiques en termes de méthodes de culture cellulaire, de caractérisation de la transcriptomique et d’imagerie. Le développement in vivo des organes se produit dans un environnement biologique qui se traduit par une auto-organisation hautement stéréotypée des arrangements cellulaires. Toute altération phénotypique peut être utilisée comme proxy pour diagnostiquer un état malade. En revanche, les organoïdes se développent in vitro dans des microenvironnements peu contrôlés compatibles avec les conditions de culture cellulaire, ce qui entraîne une grande variabilité dans la voie de développement et la formation de la forme pour chaque organoïde individuel.
Une étude récente8 a démontré que l’imagerie quantitative de la forme organoïde (descripteurs de phénotype) couplée à l’évaluation de quelques marqueurs génétiques permet de définir des paysages de développement phénotypiques. On peut soutenir que la capacité de relier la diversité de l’expression génomique chez les organoïdes à leur comportement phénotypique est une étape majeure vers la libération du plein potentiel des cultures organotypiques. Ainsi, il demande le développement d’approches d’imagerie dédiées et à haut contenu permettant la caractérisation des caractéristiques organoïdes aux échelles sous-cellulaires, multicellulaires et organoïdes entières en 3D 9,10.
Nous avons développé une plateforme polyvalente de criblage à haut contenu (HCS) permettant une culture organoïde rationalisée (à partir de cellules souches embryonnaires humaines isolées [CSEh], de cellules souches pluripotentes induites par l’homme [CSIPh] ou de cellules primaires à des organoïdes 3D, multicellulaires et différenciés) et une imagerie 3D rapide et non invasive. Il intègre un dispositif de culture cellulaire 3D miniaturisé de nouvelle génération, appelé puce JeWells (la puce ci-après), qui contient des milliers de micropuits bien disposés flanqués de miroirs à 45° qui permettent une imagerie 3D rapide et haute résolution par microscopie à feuille de lumièreà objectif unique 11. Compatible avec n’importe quel microscope inversé standard commercial, ce système permet l’imagerie de 300 organoïdes en 3D avec une résolution subcellulaire en <1 h.
La microfabrication du dispositif de culture cellulaire part d’un moule microstructuré existant, qui contient des centaines de micropyramides (Figure 1A) avec une base carrée et des parois latérales à 45° par rapport à la base. La figure 1C montre des images au microscope électronique (EM) de telles structures. Le moule lui-même est en poly(diméthylsiloxane) (PDMS) et peut être fabriqué comme une réplique moulée d’un moule primaire (non montré ici) avec les caractéristiques correspondantes (comme des cavités) en utilisant des procédures lithographiques douces standard. Le moule primaire peut être produit par différentes procédures. Celui utilisé pour ce protocole a été fabriqué à l’aide de gravure humide au silicium, comme indiqué dans Galland et al. 11; La procédure de fabrication du moule primaire n’est pas critique pour ce protocole. Les pyramides sont disposées en un réseau carré, avec le même pas pour les directions X et Y (dans ce cas, le pas est de 350 μm).
À titre d’illustration, des expériences de preuve de concept12 ont été publiées pour démontrer que la puce permet des protocoles de culture à long terme (mois) et de différenciation tout en définissant précisément le nombre de cellules initiales dans les puits. Le développement individuel d’un grand nombre d’organoïdes peut être automatiquement surveillé en direct à l’aide de microscopes à fluorescence à feuille de lumière 3D standard à fond clair. De plus, les organoïdes peuvent être récupérés pour effectuer d’autres recherches biologiques (par exemple, analyse transcriptomique). Cet article décrit les protocoles détaillés pour la fabrication des lamelles de couverture de culture cellulaire, la procédure d’ensemencement et de coloration pour la microscopie à fluorescence, ainsi que la récupération des organoïdes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure de fabrication de la boîte de culture de micropuits, qui permet la culture organoïde à haute densité et la différenciation, a été décrite dans cet article. En raison de la géométrie et de la disposition des microcavités, des milliers de sphéroïdes peuvent être cultivés et colorés dans une seule plaque pendant de longues périodes (plusieurs semaines ou plus) sans perte de matière. À titre de comparaison, une zone de 4 mm x 2 mm sur la plaque de culture cellulaire peut contenir autant de sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche est soutenue par le projet CALIPSO soutenu par la National Research Foundation, Cabinet du Premier ministre, Singapour, dans le cadre de son programme Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. remercie l’investigateur NRF-NRFI2018-07, le MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, le financement de démarrage MBI et ANR ADGastrulo. A.B. et G.G. reconnaissent le soutien du financement de base de MBI. A.B. remercie Andor Technologies pour le prêt du microscope BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
