تطعيم الشتلات القابل للتطوير والمرن والفعال من حيث التكلفة
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تطعيم الشتلات القوية التي لا تتطلب خبرة أو تدريبا مسبقا ويمكن تنفيذها بتكلفة منخفضة للغاية باستخدام مواد يسهل الوصول إليها في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية.
Abstract
أصبح تطعيم الشتلات في المراحل المبكرة أداة شائعة في علم الوراثة الجزيئية لدراسة علاقات الجذور داخل النباتات. يعد تطعيم شتلات المرحلة المبكرة من النبات النموذجي الصغير ، Arabidopsis thaliana ، تحديا تقنيا ويستغرق وقتا طويلا بسبب حجم وهشاشة شتلاته. تصف مجموعة متزايدة من الأساليب المنشورة هذه التقنية بمعدلات نجاح متفاوتة وصعوبة وتكاليف مرتبطة بها. تصف هذه الورقة إجراء بسيطا لصنع جهاز تطعيم داخلي قابل لإعادة الاستخدام باستخدام مزيج المطاط الصناعي السيليكوني ، وكيفية استخدام هذا الجهاز لتطعيم الشتلات. في وقت هذا المنشور ، كان كل جهاز تطعيم قابل لإعادة الاستخدام يكلف 0.47 دولارا فقط من المواد الاستهلاكية لإنتاجه. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمبتدئين الحصول على أول شتلة مطعمة بنجاح في أقل من 3 أسابيع من البداية إلى النهاية. سيسمح هذا الإجراء الذي يمكن الوصول إليه بشكل كبير لمختبرات علم الوراثة الجزيئية النباتية بإنشاء تطعيم الشتلات كجزء طبيعي من عمليتها التجريبية. نظرا للتحكم الكامل الذي يتمتع به المستخدمون في إنشاء وتصميم أجهزة التطعيم هذه ، يمكن تعديل هذه التقنية بسهولة للاستخدام في النباتات الكبيرة ، مثل الطماطم أو التبغ ، إذا رغبت في ذلك.
Introduction
التطعيم هو تقنية بستانية قديمة أصبحت ممارسة زراعية راسخة بحلول عام 500 قبل الميلاد1. كان تطعيم أنواع مختلفة من نباتات المحاصيل لتحسين الغلة أول استخدام لهذه التقنية ، ولا يزال يستخدم لهذا الغرض اليوم. في العقد الماضي ، اجتذب التطعيم قدرا متزايدا من الاهتمام كأداة لعلماء الأحياء الجزيئية لدراسة الإشارات بعيدة المدى في النباتات2،3،4،5. في حين أن تطعيم النباتات البالغة أمر سهل نسبيا ، فإن تطعيم النباتات بعد فترة وجيزة من الإنبات يمثل تحديا. على الرغم من ذلك ، يلزم أحيانا تقييم آثار الإشارات بعيدة المدى في عمليات مثل تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والإزهار6،7،8.
تم تأسيس Arabidopsis thaliana ككائن نموذجي في بيولوجيا النبات لأسباب عديدة ، بما في ذلك صغر حجمه نسبيا ، مما يجعل من السهل نموه داخل المختبر. ومع ذلك ، فإن صغر حجم وهشاشة شتلات Arabidopsis يجعل تطعيم الشتلات الصغيرة أمرا صعبا للغاية. في كثير من الحالات ، يلزم تدريب عملي مكثف للحصول على ترقيع الشتلات بنجاح. كانت هناك العديد من التحسينات المنهجية على مر السنين التي حددت ظروف النمو المثالية والتقنيات الجديدة لزيادة معدل نجاح تطعيم الشتلات9،10،11. كانت أحدث أداة تم تقديمها هي رقاقة تطعيم الشتلات Arabidopsis ، والتي تسمح حتى للمستخدمين عديمي الخبرة بتحقيق مستويات مقبولة من نجاح التطعيم12. في حين أن هذا التقدم قد قلل بشكل كبير من الحاجز التقني لتطعيم الشتلات ، فإن جهاز الرقاقة مكلف ، وسرعان ما يصبح عدد الطعوم التي يمكن إجراؤها بالتوازي باهظ التكلفة.
بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن استخدام هذا الجهاز إلا لشتلات Arabidopsis التي لها أبعاد hypocotyl التي تشبه الشتلات البرية. في حين أن Arabidopsis هو النوع الرئيسي في عالم علم الوراثة الجزيئية النباتية ، فقد تم القيام بعمل حديث في أنواع أخرى باستخدام تطعيم الشتلات. ومن الأمثلة على ذلك تطعيم فول الصويا والفاصوليا الشائعة ، والتبغ إلى الطماطم ، والكانولا إلى أرابيدوبسيس ، وبعد ذلك أخذ عينات من كلا الأنسجة للحمض النووي الريبي الصغير13،14. لذلك ، فإن طريقة التطعيم التي يمكن الوصول إليها من قبل معظم المختبرات ويمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية دون أي تغييرات تقنية كبيرة أمر مرغوب فيه للغاية.
يفصل هذا البروتوكول طريقة تستخدم الإنتاج الداخلي لجهاز تطعيم بسيط يسمح بالتخصيص الكامل لقطر قناة التطعيم وطولها لاستيعاب أي مورفولوجيا للشتلات عبر معظم الأنواع النباتية. إن إنتاج هذه الأجهزة ميسور التكلفة للغاية وقابل للتطوير بدرجة كبيرة ، حيث أن المكونات الوحيدة المطلوبة هي المطاط الصناعي السيليكوني ، والأسلاك أو الأنابيب بالحجم الصحيح ، وشفرة عالية الدقة ، وحاوية لتكون بمثابة قالب. باتباع بروتوكول التطعيم المفصل هنا ، يمكن للمستخدمين تحقيق معدلات تطعيم ناجحة تبلغ 45٪ (ن = 105) ، مقارنة بنتائج التطعيم المبلغ عنها سابقا10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
ملخص وأهمية
يعد تكوين اتحاد الكسب غير المشروع أمرا بالغ الأهمية لنجاح التطعيم ، الأمر الذي يتطلب اتصالا مباشرا ودون عائق بين الجذر والسليل. إن الحجم المصغر وهشاشة شتلات النباتات الصغيرة مثل Arabidopsis يجعل من الصعب تقنيا تلبية هذا المطلب. كانت إحدى التقنيات التي تم تطويرها في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا لخافيير بروموس على التدريب الأولي والتوجيه في تطعيم شتلات أرابيدوبسيس .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
