Масштабируемая, гибкая и экономичная прививка рассады
Summary
Этот протокол описывает надежный метод прививки рассады, который не требует предварительного опыта или обучения и может быть выполнен по очень низкой цене с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий молекулярной биологии.
Abstract
Ранняя стадия прививки саженцев стала популярным инструментом в молекулярной генетике для изучения взаимоотношений между корнями и побегами внутри растений. Прививка ранних саженцев небольшого модельного растения Arabidopsis thaliana является технически сложной и трудоемкой из-за размера и хрупкости его саженцев. Растущая коллекция опубликованных методов описывает эту технику с различными показателями успеха, сложностью и связанными с этим затратами. В этой статье описывается простая процедура изготовления собственного многоразового устройства для прививки с использованием смеси силиконовых эластомеров и способы использования этого устройства для прививки рассады. На момент этой публикации производство каждого многоразового прививочного устройства обходится всего в 0,47 доллара США в расходных материалах. Используя этот метод, новички могут получить свои первые успешно привитые саженцы менее чем за 3 недели от начала до конца. Эта высокодоступная процедура позволит лабораториям молекулярной генетики растений установить прививку рассады как нормальную часть своего экспериментального процесса. Благодаря полному контролю, который пользователи имеют при создании и проектировании этих устройств для прививки, этот метод может быть легко отрегулирован для использования на более крупных растениях, таких как помидоры или табак, если это необходимо.
Introduction
Прививка – это древняя садоводческая техника, которая стала устоявшейся сельскохозяйственной практикой к 500 г. до н.э.1. Прививка различных сортов сельскохозяйственных культур для повышения урожайности была первым применением этой техники и продолжает использоваться для этой цели сегодня. В последнее десятилетие прививка привлекает все большее внимание как инструмент молекулярных биологов для изучения передачи сигналов на большие расстояния у растений 2,3,4,5. В то время как прививка взрослых растений относительно проста, прививка растений вскоре после прорастания является сложной задачей. Несмотря на это, иногда требуется оценить влияние передачи сигналов на большие расстояния в таких процессах, как развитие растений, реакция окружающей среды и цветение 6,7,8.
Arabidopsis thaliana был признан модельным организмом в биологии растений по многим причинам, в том числе по относительно небольшому размеру, что позволяет легко выращивать его в лаборатории. Однако небольшой размер и хрупкость саженцев арабидопсиса делает прививку молодых саженцев очень сложной. Во многих случаях для успешного получения саженцевых трансплантатов требуется обширная практическая подготовка. За прошедшие годы было внесено много методологических усовершенствований, которые определили идеальные условия выращивания и новые методы для повышения успешности прививки саженцев 9,10,11. Самым последним представленным инструментом был чип для прививки рассады арабидопсиса, который позволяет даже неопытным пользователям достичь приемлемого уровня успеха прививки12. Несмотря на то, что этот прогресс значительно снизил технический барьер для прививки рассады, устройство чипа стоит дорого, а количество прививок, которые можно проводить параллельно, быстро становится непомерно дорогим.
Кроме того, это устройство можно использовать только для проростков арабидопсиса, которые имеют размеры гипокотиля, аналогичные саженцам дикорастущего типа. В то время как арабидопсис является краеугольным камнем в мире молекулярной генетики растений, недавняя работа была проделана и у других видов с использованием прививки рассады. Примеры включают прививку сои и фасоли обыкновенной, табака к томату и рапса к арабидопсису и последующий отбор проб обеих тканей для малых РНК13,14. Поэтому крайне желателен метод прививки, доступный для большинства лабораторий и легко адаптированный к широкому спектру видов растений без каких-либо серьезных изменений в технике.
В этом протоколе подробно описывается метод, в котором используется собственное производство простого устройства для прививки, которое позволяет полностью настроить диаметр и длину канала прививки для учета любой морфологии саженца у большинства видов растений. Производство этих устройств очень доступно по цене и легко масштабируется, так как единственными необходимыми компонентами являются силиконовый эластомер, проводка или трубка правильного размера, высокоточное лезвие и контейнер, служащий пресс-формой. Следуя протоколу прививки, подробно описанному здесь, пользователи могут достичь успешных показателей прививки 45% (n = 105), что сопоставимо с ранее сообщенными результатами прививки10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Резюме и значение
Формирование привоя имеет решающее значение для успешной прививки, которая требует прямого и беспрепятственного контакта между подвоем и привоем. Миниатюрный размер и хрупкость саженцев небольших растений, таких как арабидопсис, делает технически сл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо Хавьеру Брумосу за начальное обучение и руководство по прививке саженцев арабидопсиса .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
