Skalierbare, flexible und kostengünstige Keimlingsveredelung
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Veredelung von Keimlingen, die keine Vorkenntnisse oder Schulungen erfordert und mit sehr geringen Kosten unter Verwendung von Materialien durchgeführt werden kann, die in den meisten molekularbiologischen Labors leicht zugänglich sind.
Abstract
Die Veredelung von Sämlingen im Frühstadium ist zu einem beliebten Werkzeug in der Molekulargenetik geworden, um Wurzel-Spross-Beziehungen innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Die Veredelung von Sämlingen der kleinen Modellpflanze Arabidopsis thaliana im Frühstadium ist aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit ihrer Sämlinge technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Eine wachsende Sammlung von veröffentlichten Methoden beschreibt diese Technik mit unterschiedlichen Erfolgsraten, Schwierigkeitsgraden und damit verbundenen Kosten. In diesem Artikel wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um ein internes wiederverwendbares Pfropfgerät unter Verwendung einer Silikonelastomermischung herzustellen, und wie dieses Gerät zum Pfropfen von Sämlingen verwendet wird. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung kostet die Herstellung jedes wiederverwendbaren Pfropfgeräts nur 0,47 US-Dollar an Verbrauchsmaterialien. Mit dieser Methode können Anfänger ihre ersten erfolgreich gepfropften Sämlinge in weniger als 3 Wochen von Anfang bis Ende erhalten. Dieses leicht zugängliche Verfahren wird es Labors für Pflanzenmolekulargenetik ermöglichen, die Keimlingsveredelung als normalen Teil ihres experimentellen Prozesses zu etablieren. Aufgrund der vollen Kontrolle, die die Benutzer bei der Erstellung und Gestaltung dieser Pfropfvorrichtungen haben, kann diese Technik auf Wunsch leicht für den Einsatz in größeren Pflanzen wie Tomaten oder Tabak angepasst werden.
Introduction
Das Pfropfen ist eine alte Gartenbautechnik, die um 500 v. Chr. zu einer etablierten landwirtschaftlichen Praxis wurde1. Das Pfropfen verschiedener Sorten von Kulturpflanzen zur Verbesserung der Erträge war die erste Anwendung dieser Technik und wird auch heute noch zu diesem Zweck eingesetzt. In den letzten zehn Jahren hat die Veredelung als Werkzeug für Molekularbiologen zur Untersuchung von Fernsignalen in Pflanzen zunehmend Aufmerksamkeit erregt 2,3,4,5. Während das Pfropfen erwachsener Pflanzen relativ einfach ist, ist das Pfropfen von Pflanzen kurz nach der Keimung eine Herausforderung. Trotzdem ist es manchmal erforderlich, die Auswirkungen von Fernsignalen auf Prozesse wie Pflanzenentwicklung, Umweltreaktionen und Blüte zu bewerten 6,7,8.
Arabidopsis thaliana hat sich aus vielen Gründen als Modellorganismus in der Pflanzenbiologie etabliert, unter anderem wegen seiner relativ geringen Größe, die es einfach macht, ihn in einem Labor zu züchten. Die geringe Größe und Zerbrechlichkeit von Arabidopsis-Sämlingen macht das Pfropfen junger Sämlinge jedoch sehr schwierig. In vielen Fällen ist ein umfangreiches praktisches Training erforderlich, um erfolgreich Sämlingstransplantate zu erhalten. Im Laufe der Jahre gab es viele methodische Verbesserungen, die ideale Wachstumsbedingungen und neue Techniken zur Erhöhung der Erfolgsrate der Sämlingsveredelung identifizierthaben 9,10,11. Das zuletzt eingeführte Werkzeug war ein Arabidopsis-Sämlings-Pfropfchip, der es auch unerfahrenen Anwendern ermöglicht, ein akzeptables Maß an Pfropferfolg zu erzielen12. Während dieser Fortschritt die technische Barriere der Keimlingsveredelung erheblich gesenkt hat, ist die Chip-Vorrichtung teuer, und die Anzahl der Transplantate, die parallel durchgeführt werden können, wird schnell unerschwinglich.
Darüber hinaus kann dieses Gerät nur für Arabidopsis-Sämlinge verwendet werden, deren Hypokotylabmessungen denen von Wildtyp-Sämlingen ähneln. Während Arabidopsis die Schlüsselart in der Welt der pflanzlichen Molekulargenetik ist, wurden neuere Arbeiten bei anderen Arten unter Verwendung der Sämlingspfropfung durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Veredelung von Sojabohnen und der gemeinen Bohne, Tabak zu Tomaten und Raps zu Arabidopsis und die anschließende Probenahme beider Gewebe auf kleine RNAs13,14. Daher ist eine Pfropfmethode, die für die meisten Laboratorien zugänglich ist und ohne größere technische Änderungen leicht an eine Vielzahl von Pflanzenarten angepasst werden kann, sehr wünschenswert.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine einfache Pfropfvorrichtung im eigenen Haus hergestellt wird, die die vollständige Anpassung des Durchmessers und der Länge des Pfropfkanals ermöglicht, um die Morphologie der Sämlinge bei den meisten Pflanzenarten zu berücksichtigen. Die Herstellung dieser Geräte ist sehr kostengünstig und hochgradig skalierbar, da die einzigen Komponenten, die benötigt werden, Silikonelastomer, Kabel oder Schläuche der richtigen Größe, eine hochpräzise Klinge und ein Behälter sind, der als Form dient. Nach dem hier beschriebenen Pfropfprotokoll können Anwender erfolgreiche Pfropfraten von 45% (n = 105) erreichen, vergleichbar mit den zuvor berichteten Pfropfergebnissen10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zusammenfassung und Bedeutung
Die Bildung einer Transplantatvereinigung ist entscheidend für eine erfolgreiche Pfropfung, die einen direkten und ungestörten Kontakt zwischen Wurzelstock und Spross erfordert. Die Miniaturgröße und Zerbrechlichkeit von Sämlingen kleiner Pflanzen wie Arabidopsis macht es technisch schwierig, diese Anforderung zu erfüllen. Eine Technik, die in frühen Arabidopsis-Sämlingspfropfmethoden entwickelt wurde, bestand darin, sowohl den Spross als auch den Wurzels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an Javier Brumos für die Erstausbildung und Anleitung bei der Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
