Enxertia de mudas escalável, flexível e econômica
Summary
Este protocolo descreve um método robusto de enxertia de plântulas que não requer experiência ou treinamento prévio e pode ser executado a um custo muito baixo usando materiais de fácil acesso na maioria dos laboratórios de biologia molecular.
Abstract
A enxertia de plântulas em estágio inicial tornou-se uma ferramenta popular em genética molecular para estudar as relações raiz-parte aérea dentro das plantas. A enxertia de mudas em estágio inicial da pequena planta-modelo, Arabidopsis thaliana, é tecnicamente desafiadora e demorada devido ao tamanho e fragilidade de suas mudas. Uma coleção crescente de métodos publicados descreve essa técnica com diferentes taxas de sucesso, dificuldade e custos associados. Este trabalho descreve um procedimento simples para fazer um dispositivo de enxertia reutilizável in house usando mistura de elastômero de silicone, e como usar esse dispositivo para enxertia de plântulas. No momento desta publicação, cada dispositivo de enxertia reutilizável custa apenas US$ 0,47 em materiais consumíveis para produzir. Usando este método, os iniciantes podem ter suas primeiras mudas enxertadas com sucesso em menos de 3 semanas do início ao fim. Este procedimento altamente acessível permitirá que os laboratórios de genética molecular de plantas estabeleçam a enxertia de plântulas como parte normal de seu processo experimental. Devido ao total controle que os usuários têm na criação e design desses dispositivos de enxertia, essa técnica poderia ser facilmente ajustada para uso em plantas maiores, como tomate ou tabaco, se desejado.
Introduction
A enxertia é uma técnica hortícola antiga que se tornou uma prática agrícola estabelecida por volta de 500 a.C.1. A enxertia de diferentes variedades de plantas cultivadas para melhorar a produtividade foi o primeiro uso dessa técnica, e continua sendo utilizada para esse fim até hoje. Na última década, a enxertia tem atraído cada vez mais atenção como ferramenta para biólogos moleculares estudarem a sinalização de longa distância em plantas 2,3,4,5. Enquanto enxertar plantas adultas é relativamente fácil, enxertar plantas logo após a germinação é um desafio. Apesar disso, algumas vezes é necessário avaliar os efeitos da sinalização de longa distância em processos como o desenvolvimento das plantas, as respostas ambientais e o florescimento 6,7,8.
Arabidopsis thaliana foi estabelecido como o organismo modelo na biologia vegetal por muitas razões, incluindo seu tamanho relativamente pequeno, facilitando o crescimento dentro de um laboratório. No entanto, o pequeno tamanho e a fragilidade das mudas de Arabidopsis tornam a enxertia de mudas jovens muito desafiadora. Em muitos casos, é necessário treinamento prático extensivo para obter enxertos de plântulas com sucesso. Ao longo dos anos, houve muitos avanços metodológicos que identificaram condições ideais de cultivo e novas técnicas para aumentar a taxa de sucesso da enxertia de plântulas9,10,11. A ferramenta mais recente introduzida foi um chip de enxertia de plântulas de Arabidopsis, que permite que mesmo usuários inexperientes alcancem níveis aceitáveis de sucesso de enxertia12. Embora esse avanço tenha reduzido significativamente a barreira técnica da enxertia de plântulas, o dispositivo de chip é caro, e o número de enxertos que podem ser conduzidos em paralelo rapidamente se torna proibitivo.
Além disso, este dispositivo só pode ser usado para mudas de Arabidopsis que tenham dimensões de hipocótilo semelhantes às mudas selvagens. Embora Arabidopsis seja a espécie-chave no mundo da genética molecular de plantas, trabalhos recentes têm sido feitos em outras espécies usando enxertia de plântulas. Exemplos incluem a enxertia de soja e feijão, tabaco para tomate e canola para Arabidopsis e, posteriormente, amostragem de ambos os tecidos para pequenos RNAs13,14. Portanto, um método de enxertia acessível à maioria dos laboratórios e que possa ser facilmente adaptado a uma ampla gama de espécies vegetais sem grandes alterações técnicas é altamente desejável.
Este protocolo detalha um método que emprega a produção interna de um dispositivo de enxertia simples que permite a personalização completa do diâmetro e comprimento do canal de enxertia para acomodar qualquer morfologia de plântula na maioria das espécies vegetais. A produção desses dispositivos é muito acessível e altamente escalável, pois os únicos componentes necessários são elastômero de silicone, fiação ou tubulação do tamanho correto, uma lâmina de alta precisão e um recipiente para servir como molde. Seguindo o protocolo de enxertia aqui detalhado, os usuários podem obter taxas de enxertia bem-sucedidas de 45% (n = 105), comparáveis aos resultados de enxertia previamente relatados10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resumo e significado
A formação de uma união do enxerto é crucial para o sucesso da enxertia, que requer contato direto e ininterrupto entre o porta-enxerto e a muda. O tamanho em miniatura e a fragilidade das mudas de pequenas plantas, como Arabidopsis, tornam tecnicamente desafiador atender a esse requisito. Uma técnica desenvolvida nos primeiros métodos de enxertia de plântulas de Arabidopsis foi inserir tanto a copa quanto o porta-enxerto em um colar curto de tubos de sili…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Obrigado a Javier Brumos pelo treinamento inicial e orientação na enxertia de mudas de Arabidopsis .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
References
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
