स्केलेबल, लचीला और लागत प्रभावी अंकुर ग्राफ्टिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल एक मजबूत अंकुर ग्राफ्टिंग विधि का वर्णन करता है जिसके लिए कोई पूर्व अनुभव या प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है और अधिकांश आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में आसानी से सुलभ सामग्री का उपयोग करके बहुत कम लागत पर निष्पादित किया जा सकता है।
Abstract
प्रारंभिक चरण अंकुर ग्राफ्टिंग पौधों के भीतर रूट-शूट संबंधों का अध्ययन करने के लिए आणविक आनुवंशिकी में एक लोकप्रिय उपकरण बन गया है। छोटे मॉडल पौधे, एराबिडोप्सिस थैलियाना के शुरुआती चरण के पौधों को ग्राफ्टिंग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और इसके रोपाई के आकार और नाजुकता के कारण समय लेने वाला है। प्रकाशित विधियों का एक बढ़ता संग्रह इस तकनीक का वर्णन अलग-अलग सफलता दर, कठिनाई और संबंधित लागतों के साथ करता है। यह पेपर सिलिकॉन इलास्टोमर मिश्रण का उपयोग करके इन-हाउस पुन: प्रयोज्य ग्राफ्टिंग डिवाइस बनाने के लिए एक सरल प्रक्रिया का वर्णन करता है, और अंकुर ग्राफ्टिंग के लिए इस उपकरण का उपयोग कैसे करें। इस प्रकाशन के समय, प्रत्येक पुन: प्रयोज्य ग्राफ्टिंग डिवाइस का उत्पादन करने के लिए उपभोग्य सामग्री में केवल $ 0.47 की लागत आती है। इस विधि का उपयोग करके, शुरुआती लोग शुरू से अंत तक 3 सप्ताह से भी कम समय में अपने पहले सफलतापूर्वक ग्राफ्टेड रोपाई कर सकते हैं। यह अत्यधिक सुलभ प्रक्रिया पौधे आणविक आनुवंशिकी प्रयोगशालाओं को उनकी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के सामान्य भाग के रूप में अंकुर ग्राफ्टिंग स्थापित करने की अनुमति देगी। इन ग्राफ्टिंग उपकरणों के निर्माण और डिजाइन में उपयोगकर्ताओं के पूर्ण नियंत्रण के कारण, इस तकनीक को बड़े पौधों, जैसे टमाटर या तंबाकू में उपयोग के लिए आसानी से समायोजित किया जा सकता है, यदि वांछित हो।
Introduction
ग्राफ्टिंग एक प्राचीन बागवानी तकनीक है जो 500ईसा पूर्व तक एक स्थापित कृषि अभ्यास बन गई। पैदावार में सुधार के लिए फसल पौधों की विभिन्न किस्मों को ग्राफ्टिंग करना इस तकनीक का पहला उपयोग था, और आज भी इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जाता है। पिछले दशक में, ग्राफ्टिंग ने पौधों 2,3,4,5 में लंबी दूरी के सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए आणविक जीवविज्ञानी के लिए एक उपकरण के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। जबकि वयस्क पौधों को ग्राफ्टिंग करना अपेक्षाकृत आसान है, अंकुरण के तुरंत बाद पौधों को ग्राफ्टिंग करना चुनौतीपूर्ण है। इसके बावजूद, कभी-कभी पौधे के विकास, पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं और फूल 6,7,8 जैसी प्रक्रियाओं में लंबी दूरी के सिग्नलिंग के प्रभावों का आकलन करना आवश्यक होता है।
एराबिडोप्सिस थैलियाना को कई कारणों से पौधे जीव विज्ञान में मॉडल जीव के रूप में स्थापित किया गया है, जिसमें इसका अपेक्षाकृत छोटा आकार भी शामिल है, जिससे प्रयोगशाला के अंदर बढ़ना आसान हो जाता है। हालांकि, एराबिडोप्सिस रोपाई का छोटा आकार और नाजुकता युवा रोपाई को बहुत चुनौतीपूर्ण बनाती है। कई मामलों में, अंकुर ग्राफ्ट को सफलतापूर्वक प्राप्त करने के लिए व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। पिछले कुछ वर्षों में कई पद्धतिगत सुधार हुए हैं जिन्होंने अंकुर ग्राफ्टिंग की सफलता दर 9,10,11 को बढ़ाने के लिए आदर्श बढ़ती स्थितियों और नई तकनीकों की पहचान की है। पेश किया गया सबसे हालिया उपकरण एक एराबिडोप्सिस सीडलिंग ग्राफ्टिंग चिप था, जो अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को ग्राफ्टिंग सफलता के स्वीकार्य स्तर को प्राप्त करने की अनुमतिदेता है। हालांकि इस अग्रिम ने अंकुर ग्राफ्टिंग की तकनीकी बाधा को काफी कम कर दिया है, चिप डिवाइस महंगा है, और समानांतर में आयोजित किए जा सकने वाले ग्राफ्ट की संख्या जल्दी से लागत-निषेधात्मक हो जाती है।
इसके अतिरिक्त, इस उपकरण का उपयोग केवल एराबिडोप्सिस रोपाई के लिए किया जा सकता है जिसमें हाइपोकोटाइल आयाम होते हैं जो जंगली प्रकार के रोपाई के समान होते हैं। जबकि एराबिडोप्सिस पौधों के आणविक आनुवंशिकी की दुनिया में कीस्टोन प्रजाति है, हाल ही में अंकुर ग्राफ्टिंग का उपयोग करके अन्य प्रजातियों में काम किया गया है। उदाहरणों में सोयाबीन और आम बीन, टमाटर को तंबाकू और एराबिडोप्सिस के लिए कैनोला की ग्राफ्टिंग शामिल है, और बाद में छोटे आरएनए13,14 के लिए दोनों ऊतकों का नमूना लिया गया है। इसलिए, एक ग्राफ्टिंग विधि जो अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है और आसानी से किसी भी प्रमुख तकनीक परिवर्तन के बिना पौधों की प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित की जा सकती है, अत्यधिक वांछनीय है।
यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि का विवरण देता है जो एक साधारण ग्राफ्टिंग डिवाइस के इन-हाउस उत्पादन को नियोजित करता है जो अधिकांश पौधों की प्रजातियों में किसी भी अंकुर आकृति विज्ञान को समायोजित करने के लिए ग्राफ्टिंग चैनल व्यास और लंबाई के पूर्ण अनुकूलन की अनुमति देता है। इन उपकरणों का उत्पादन बहुत सस्ती और अत्यधिक स्केलेबल है, क्योंकि आवश्यक एकमात्र घटक सिलिकॉन इलास्टोमर, सही आकार के वायरिंग या टयूबिंग, एक उच्च परिशुद्धता ब्लेड और एक मोल्ड के रूप में सेवा करने के लिए एक कंटेनर हैं। यहां विस्तृत ग्राफ्टिंग प्रोटोकॉल के बाद, उपयोगकर्ता 45% (एन = 105) की सफल ग्राफ्टिंग दर प्राप्त कर सकते हैं, जो पहले रिपोर्ट किए गए ग्राफ्टिंगपरिणामों 10,12 के साथ तुलनीय है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सारांश और महत्व
सफल ग्राफ्टिंग के लिए एक ग्राफ्ट यूनियन का गठन महत्वपूर्ण है, जिसके लिए रूटस्टॉक और साइऑन के बीच सीधे और अबाधित संपर्क की आवश्यकता होती है। एराबिडोप्सिस जैसे छोटे पौधों के प…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एराबिडोप्सिस रोपाई में प्रारंभिक प्रशिक्षण और मार्गदर्शन के लिए जेवियर ब्रूमोस को धन्यवाद।
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
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