Analyse af T-cellereceptor-induceret calciumtilstrømning i primære murin-T-celler ved fuldspektret flowcytometri
Summary
Calciumtilstrømning, et mål for T-cellesignalering, er en effektiv måde at analysere reaktioner på T-cellereceptorstimulering. Denne protokol til multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler udnytter de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri.
Abstract
Calciumtilstrømning som reaktion på T-cellereceptorstimulering er et almindeligt mål for T-cellesignalering. Flere calciumindikatorfarvestoffer er blevet udviklet til vurdering af calciumsignalering ved båndpasflowcytometri. Denne protokol er designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Samlede splenocytter er mærket med det ratiometriske calciumindikatorfarvestof Indo-1 sammen med et panel af fluorkromkonjugerede antistoffer mod celleoverflademolekyler. Udnyttelse af mulighederne for fuldspektret flowcytometri giver en platform til udnyttelse af en bred vifte af celleoverfladepletter i kombination med Indo-1. Celler analyseres derefter i realtid ved 37 °C før og efter tilsætning af et anti-CD3-antistof for at stimulere T-cellereceptoren. Efter blanding af spektralsignalerne beregnes forholdet mellem calciumbundet og calciumfrit Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver lukket population af splenocytter. Denne teknik kan muliggøre samtidig analyse af calciumresponser i flere cellepopulationer.
Introduction
T-cellereceptor (TCR) induceret calciumtilstrømning er et nyttigt mål for T-celleaktivering og bruges ofte til at bestemme, om en population af T-celler har nedsat respons i de proksimale trin i TCR-signalvejen1. Målinger af calciumtilstrømning udføres generelt ved at præmærke T-cellerne med et eller et par fluorescerende calciumindikatorfarvestoffer og derefter undersøge de fluorescerende signaler ved hjælp af flowcytometri i realtid efter TCR-tværbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk calciumfarvestof, er ophidset af UV-laseren med maksimale emissioner ved to forskellige bølgelængder afhængig af calciumbinding5 og er et almindeligt anvendt indikatorfarvestof til flowcytometrianalyse af calciumresponser i levende lymfocytter. Da emissionsprofilen for Indo-1 er ret bred, kan det være udfordrende at kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse af flere celleoverflademarkører ved båndpasflowcytometri. Denne begrænsning begrænser brugen af flowcytometrianalyse af calciumresponser til prærensede populationer af T-celler eller til populationer identificeret ved et begrænset sæt celleoverflademolekyler.
For at løse begrænsningerne ved måling af calciumresponser på heterogene populationer af primære lymfocytter ved hjælp af båndpasflowcytometri blev der udviklet en protokol til måling af Indo-1-fluorescens ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Denne metode giver mulighed for multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler og drager fordel af de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri. Fordelen ved at anvende fuldspektret flowcytometri frem for konventionel flowcytometri er dens evne til at skelne fluorescerende signaler fra stærkt overlappende farvestoffer og derved øge antallet af overflademarkører, der kan vurderes samtidigt i hver prøve. Konventionel flowcytometri bruger båndpasfiltre og er begrænset til en fluorochrom pr. Detektorsystem6. Fuldspektret flowcytometri indsamler signaler over hele spektret af fluorochromen ved hjælp af 64 detektorer på et fem-laser spektral flowcytometrisystem 7,8. Derudover drager fuldspektret flowcytometri fordel af APD (Avalanche Photo Diode) detektorer, der har øget følsomhed i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer, der findes på konventionelle flowcytometre8. Derfor er denne tilgang ideel til de heterogene cellepopulationer, såsom mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensioner, da det eliminerer behovet for isolering af specifikke T-cellepopulationer før calciumfarvestofmærkning. I stedet kan celleoverflademarkørekspressionsprofiler og flowcytometri-gating efter dataindsamling bruges til at vurdere calciumresponser i hver population af interesse. Som vist i denne rapport kan Indo-1 let kombineres med otte fluorkromkonjugerede antistoffer, hvilket resulterer i i alt 10 unikke spektrale signaturer. Desuden kan denne metode let anvendes på blandinger af celler fra genisk forskellige muselinjer, hvilket muliggør samtidig analyse af calciumresponser i vildtype-T-celler sammenlignet med dem fra en genmålrettet muselinje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver et optimeret assay designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler fyldt med titreret Indo-1 ratiometrisk indikatorfarvestof ved hjælp af fuldspektret flowcytometri 7,8. Fordelen ved at udføre calciumfluxassays ved hjælp af fuldspektret flowcytometri er evnen til at multiplexere overfladecellemarkørfarvning i kombination med vurdering af Indo-1-fluorescens. Fuldspektret flowcytometri har den fordel, at det tillader an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_021321, Mange tak til vores kolleger hos Cytek for løbende diskussioner af fuld spektral cytometrisk analyse på Aurora og SpectroFlo software. Figurer blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022)
- SpctroFlo Software. Cytek Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022)
- FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022)
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
