फुल स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में टी-सेल रिसेप्टर-प्रेरित कैल्शियम प्रवाह का विश्लेषण
Summary
कैल्शियम प्रवाह, टी-सेल सिग्नलिंग का एक उपाय, टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना के लिए प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने का एक प्रभावी तरीका है। सेल सतह अणुओं पर निर्देशित एंटीबॉडी के पैनलों के साथ इंडो -1 को मल्टीप्लेक्स करने के लिए यह प्रोटोकॉल पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री की अत्यधिक लचीली क्षमताओं का लाभ उठाता है।
Abstract
टी-सेल रिसेप्टर उत्तेजना के जवाब में कैल्शियम प्रवाह टी-सेल सिग्नलिंग का एक सामान्य उपाय है। बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कैल्शियम सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए कई कैल्शियम संकेतक रंजक विकसित किए गए हैं। यह प्रोटोकॉल पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। कुल स्प्लेनोसाइट्स को सेल सतह अणुओं के लिए फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ अनुपातमेट्रिक कैल्शियम संकेतक डाई इंडो -1 के साथ लेबल किया जाता है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री की क्षमताओं का लाभ उठाना इंडो -1 के साथ संयोजन में सेल सतह के दाग की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। टी-सेल रिसेप्टर को उत्तेजित करने के लिए एंटी-सीडी 3 एंटीबॉडी को जोड़ने से पहले और बाद में कोशिकाओं का वास्तविक समय में 37 डिग्री सेल्सियस पर विश्लेषण किया जाता है। वर्णक्रमीय संकेतों को अनमिक्स करने के बाद, कैल्शियम-बाध्य और कैल्शियम मुक्त इंडो -1 के अनुपात की गणना की जाती है और स्प्लेनोसाइट्स की प्रत्येक गेटेड आबादी के लिए समय के साथ कल्पना की जा सकती है। यह तकनीक कई सेल आबादी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के एक साथ विश्लेषण की अनुमति दे सकती है।
Introduction
टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) प्रेरित कैल्शियम प्रवाह टी-सेल सक्रियण का एक उपयोगी उपाय है और अक्सर यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि टी-कोशिकाओं की आबादी ने टीसीआर सिग्नलिंग मार्ग1 के समीपस्थ चरणों में बिगड़ा हुआ प्रतिक्रियाएं हैं या नहीं। कैल्शियम प्रवाह के माप आम तौर पर टी-कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक रंगों की एक या एक जोड़ी के साथ पूर्व-लेबल करके किए जाते हैं, और फिर टीसीआर क्रॉस-लिंकिंग 2,3,4 के बाद वास्तविक समय में फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके फ्लोरोसेंटसंकेतों की जांच करते हैं। इंडो -1, एक अनुपात-मीट्रिक कैल्शियम डाई, कैल्शियम बाइंडिंग5 पर निर्भर दो अलग-अलग तरंग दैर्ध्य पर चरम उत्सर्जन के साथ यूवी लेजर द्वारा उत्साहित है, और जीवित लिम्फोसाइटों में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला संकेतक डाई है। चूंकि इंडो -1 का उत्सर्जन प्रोफाइल काफी व्यापक है, इसलिए बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री द्वारा कई सेल सतह मार्करों के एक साथ विश्लेषण के साथ इंडो -1 मूल्यांकन को जोड़ना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह सीमा टी-कोशिकाओं की पूर्व-शुद्ध आबादी या सेल सतह अणुओं के सीमित सेट द्वारा पहचानी गई आबादी के लिए कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के उपयोग को प्रतिबंधित करती है।
बैंड-पास फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके प्राथमिक लिम्फोसाइटों की विषम आबादी पर कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने की सीमाओं को संबोधित करने के लिए, पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इंडो -1 फ्लोरेसेंस को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। यह विधि पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री की अत्यधिक लचीली क्षमताओं का लाभ उठाते हुए, सेल सतह अणुओं पर निर्देशित एंटीबॉडी के पैनलों के साथ इंडो -1 को मल्टीप्लेक्स करने की अनुमति देती है। पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री पर पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने का लाभ फ्लोरोसेंट संकेतों को अत्यधिक अतिव्यापी रंगों से अलग करने की क्षमता है, जिससे सतह मार्करों की संख्या बढ़ जाती है जिन्हें प्रत्येक नमूने में एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। पारंपरिक फ्लो साइटोमेट्री बैंडपास फिल्टर का उपयोग करता है और एक फ्लोरोक्रोम प्रति डिटेक्टर सिस्टम6 तक सीमित है। पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री पांच-लेजर वर्णक्रमीय प्रवाह साइटोमेट्री सिस्टम 7,8 पर 64 डिटेक्टरों का उपयोग करके फ्लोरोक्रोम के पूरे स्पेक्ट्रम में संकेत एकत्र करता है। इसके अलावा, पूर्ण स्पेक्ट्रम प्रवाह साइटोमेट्री एपीडी (हिमस्खलन फोटो डायोड) डिटेक्टरों का लाभ उठाती है जिन्होंने पारंपरिक प्रवाह साइटोमीटर 8 पर मौजूद फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब डिटेक्टरों के सापेक्ष संवेदनशीलता में वृद्धि कीहै। नतीजतन, यह दृष्टिकोण विषम कोशिका आबादी के लिए आदर्श है, जैसे परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं या मुराइन माध्यमिक लिम्फोइड अंग कोशिका निलंबन, क्योंकि यह कैल्शियम डाई लेबलिंग से पहले विशिष्ट टी-सेल आबादी के अलगाव की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके बजाय, डेटा संग्रह के बाद सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल और फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग का उपयोग रुचि की प्रत्येक आबादी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि इस रिपोर्ट में दिखाया गया है, इंडो -1 को आसानी से आठ फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कुल 10 अद्वितीय वर्णक्रमीय हस्ताक्षर होते हैं। इसके अलावा, इस विधि को आसानी से अलग-अलग माउस लाइनों से कोशिकाओं के मिश्रण पर लागू किया जा सकता है, जिससे जीन-लक्षित माउस लाइन की तुलना में जंगली-प्रकार की टी-कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं के एक साथ विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एक अनुकूलित परख का वर्णन करता है जो पूर्ण स्पेक्ट्रम फ्लो साइटोमेट्री 7,8 का उपयोग करके टाइटरेटेड इंडो -1 अनुपातमेट्रिक संकेतक डाई से भरी प्राथमिक मुराइन टी-कोशिकाओं …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01AI132419, सीयू | एएमसी इम्यूनोमाइक्रो फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन, आरआरआईडी: SCR_021321, ऑरोरा और स्पेक्ट्रोफ्लो सॉफ्टवेयर पर पूर्ण वर्णक्रमीय साइटोमेट्रिक विश्लेषण की निरंतर चर्चा के लिए साइटेक में हमारे सहयोगियों के लिए बहुत धन्यवाद। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
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