Kalsiuminnstrømning, et mål på T-cellesignalering, er en effektiv måte å analysere responser på T-cellereseptorstimulering. Denne protokollen for multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri.
Kalsiuminnstrømning som respons på T-cellereseptorstimulering er et vanlig mål for T-cellesignalering. Flere kalsiumindikatorfargestoffer er utviklet for å vurdere kalsiumsignalering ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne protokollen er utformet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler ved bruk av fullspektret flowcytometri. Totale splenocytter er merket med ratiometrisk kalsiumindikatorfargestoff Indo-1, sammen med et panel av fluorokrom-konjugerte antistoffer mot celleoverflatemolekyler. Utnyttelse av egenskapene til fullspektret flowcytometri gir en plattform for å utnytte et bredt utvalg av celleoverflateflekker i kombinasjon med Indo-1. Cellene analyseres deretter i sanntid ved 37 °C før og etter tilsetning av et anti-CD3-antistoff for å stimulere T-cellereseptoren. Etter å ha blandet spektralsignalene, beregnes forholdet mellom kalsiumbundet og kalsiumfritt Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver inngjerdede populasjon av splenocytter. Denne teknikken kan tillate samtidig analyse av kalsiumresponser i flere cellepopulasjoner.
T-cellereseptor (TCR) indusert kalsiuminnstrømning er et nyttig mål på T-celleaktivering og brukes ofte til å avgjøre om en populasjon av T-celler har svekkede responser i de proksimale trinnene i TCR-signalveien1. Målinger av kalsiuminnstrømning utføres vanligvis ved å forhåndsmerke T-cellene med ett eller et par fluorescerende kalsiumindikatorfargestoffer, og deretter undersøke de fluorescerende signalene ved hjelp av flowcytometri i sanntid etter TCR-kryssbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk kalsiumfargestoff, er begeistret av UV-laseren med topputslipp ved to forskjellige bølgelengder avhengig av kalsiumbinding5, og er et vanlig brukt indikatorfargestoff for flowcytometrianalyse av kalsiumresponser i levende lymfocytter. Siden emisjonsprofilen til Indo-1 er ganske bred, kan det være utfordrende å kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse av flere celleoverflatemarkører ved hjelp av båndpassflowcytometri. Denne begrensningen begrenser bruken av flowcytometrianalyse av kalsiumresponser til forhåndsrensede populasjoner av T-celler eller til populasjoner identifisert av et begrenset sett med molekyler på celleoverflaten.
For å løse begrensningene ved måling av kalsiumrespons på heterogene populasjoner av primære lymfocytter ved bruk av båndpassflowcytometri, ble det utviklet en protokoll for å måle Indo-1-fluorescens ved bruk av fullspektret flowcytometri. Denne metoden tillater multipleksing av Indo-1 med paneler av antistoffer rettet mot celleoverflatemolekyler, og utnytter de svært fleksible egenskapene til fullspektret flowcytometri. Fordelen med å bruke fullspektret flowcytometri fremfor konvensjonell flowcytometri er evnen til å skille fluorescerende signaler fra sterkt overlappende fargestoffer, og dermed øke antall overflatemarkører som kan vurderes samtidig i hver prøve. Konvensjonell flowcytometri bruker båndpassfiltre og er begrenset til ett fluorokrom per detektorsystem6. Full spektrum flowcytometri samler signaler over hele spekteret av fluorokrom ved hjelp av 64 detektorer på et fem-laser spektralt flowcytometrisystem 7,8. I tillegg utnytter fullspektret flowcytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har økt følsomhet i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer som finnes på konvensjonelle strømningscytometre8. Følgelig er denne tilnærmingen ideell for heterogene cellepopulasjoner, for eksempel mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensjoner, da det eliminerer behovet for isolering av spesifikke T-cellepopulasjoner før kalsiumfargestoffmerking. I stedet kan ekspresjonsprofiler for celleoverflatemarkører og flowcytometrigating etter datainnsamling brukes til å vurdere kalsiumresponser i hver populasjon av interesse. Som vist i denne rapporten, kan Indo-1 lett kombineres med åtte fluorokrom-konjugerte antistoffer, noe som resulterer i totalt 10 unike spektrale signaturer. Videre kan denne metoden lett brukes på blandinger av celler fra kongenisk distinkte muselinjer, noe som muliggjør samtidig analyse av kalsiumresponser i villtype T-celler sammenlignet med de fra en genmålrettet muselinje.
Denne protokollen beskriver en optimalisert analyse designet for å måle kalsiumresponser i primære murine T-celler lastet med titrert Indo-1 ratiometrisk indikatorfargestoff ved bruk av fullspektret flowcytometri 7,8. Fordelen med å utføre kalsiumfluksanalyser ved bruk av fullspektret flowcytometri er evnen til å multiplekse overflatecellemarkørfarging i kombinasjon med vurdering av Indo-1-fluorescens. Fullspektret flowcytometri har fordelen av å tillate …
The authors have nothing to disclose.
R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Tusen takk til våre kolleger i Cytek for kontinuerlige diskusjoner om full spektral cytometrisk analyse av programvaren Aurora og SpectroFlo. Figurer ble laget med BioRender.com.
12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
CD1d Tetramer APC | NIH | ||
CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
Cell Incubator | Formal Scientific | ||
Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
EGTA | Fisher | NC1280093 | |
FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
Waterbath | Fisher Brand Dry bath |