Analys av T-cellreceptorinducerad kalciuminflöde i primära murina T-celler med fullspektrumflödescytometri

Summary

Kalciuminflöde, ett mått på T-cellsignalering, är ett effektivt sätt att analysera svar på T-cellreceptorstimulering. Detta protokoll för multiplexering av Indo-1 med paneler av antikroppar riktade mot cellytemolekyler utnyttjar de mycket flexibla funktionerna hos fullspektrumflödescytometri.

Abstract

Kalciuminflöde som svar på T-cellreceptorstimulering är ett vanligt mått på T-cellsignalering. Flera kalciumindikatorfärgämnen har utvecklats för att bedöma kalciumsignalering med bandpassflödescytometri. Detta protokoll är utformat för att mäta kalciumsvar i primära murina T-celler med hjälp av fullspektrumflödescytometri. Totala splenocyter är märkta med det ratiometriska kalciumindikatorfärgämnet Indo-1, tillsammans med en panel av fluorkromkonjugerade antikroppar mot cellytmolekyler. Att utnyttja kapaciteten hos fullspektrumflödescytometri ger en plattform för att använda ett brett spektrum av cellytefläckar i kombination med Indo-1. Cellerna analyseras sedan i realtid vid 37 °C före och efter tillsats av en anti-CD3-antikropp för att stimulera T-cellreceptorn. Efter blandning av spektralsignalerna beräknas förhållandet mellan kalciumbundet och kalciumfritt Indo-1 och kan visualiseras över tid för varje gated population av splenocyter. Denna teknik kan möjliggöra samtidig analys av kalciumsvar i flera cellpopulationer.

Introduction

T-cellreceptor (TCR) inducerad kalciuminflöde är ett användbart mått på T-cellaktivering och används ofta för att bestämma om en population av T-celler har nedsatt respons i de proximala stegen i TCR-signalvägen¹. Mätningar av kalciuminflöde utförs vanligtvis genom att T-cellerna förmärks med ett eller ett par fluorescerande kalciumindikatorfärgämnen och sedan undersöker de fluorescerande signalerna med hjälp av flödescytometri i realtid efter TCR-tvärbindning ^2,3,4. Indo-1, ett kvotmetriskt kalciumfärgämne, exciteras av UV-lasern med topputsläpp vid två olika våglängder beroende på kalciumbindning⁵, och är ett vanligt indikatorfärgämne för flödescytometrianalys av kalciumsvar i levande lymfocyter. Eftersom emissionsprofilen för Indo-1 är ganska bred kan det vara utmanande att kombinera Indo-1-bedömning med samtidig analys av flera cellytemarkörer med bandpassflödescytometri. Denna begränsning begränsar användningen av flödescytometrianalys av kalciumsvar till förrenade populationer av T-celler eller till populationer identifierade av en begränsad uppsättning cellytemolekyler.

För att ta itu med begränsningarna för att mäta kalciumsvar på heterogena populationer av primära lymfocyter med hjälp av bandpassflödescytometri utvecklades ett protokoll för att mäta Indo-1-fluorescens med fullspektrumflödescytometri. Denna metod möjliggör multiplexering av Indo-1 med paneler av antikroppar riktade mot cellytemolekyler, vilket utnyttjar de mycket flexibla funktionerna hos fullspektrumflödescytometri. Fördelen med att använda fullspektrumflödescytometri jämfört med konventionell flödescytometri är dess förmåga att skilja de fluorescerande signalerna från mycket överlappande färgämnen, vilket ökar antalet ytmarkörer som samtidigt kan bedömas i varje prov. Konventionell flödescytometri använder bandpassfilter och är begränsad till en fluorokrom per detektorsystem⁶. Fullspektrumflödescytometri samlar signaler över hela spektrumet av fluorokrom med hjälp av 64 detektorer på ett femlaserspektralflödescytometrisystem ^7,8. Dessutom utnyttjar fullspektrumflödescytometri APD-detektorer (Avalanche Photo Diode) som har ökad känslighet i förhållande till fotomultiplikatorrördetektorer som finns på konventionella flödescytometrar⁸. Följaktligen är detta tillvägagångssätt idealiskt för de heterogena cellpopulationerna, såsom perifera mononukleära celler eller murina sekundära lymfoida organcellsuspensioner, eftersom det eliminerar behovet av isolering av specifika T-cellpopulationer före kalciumfärgmärkning. Istället kan cellytemarköruttrycksprofiler och flödescytometri gating efter datainsamling användas för att bedöma kalciumsvar i varje population av intresse. Som framgår av denna rapport kan Indo-1 enkelt kombineras med åtta fluorkromkonjugerade antikroppar, vilket resulterar i totalt 10 unika spektrala signaturer. Dessutom kan denna metod lätt tillämpas på blandningar av celler från kongeniskt distinkta muslinjer, vilket möjliggör samtidig analys av kalciumsvar i T-celler av vildtyp jämfört med dem från en genriktad muslinje.

Protocol

Möss upprätthölls vid University of Colorado Anschutz Medical campus i enlighet med IACUC-protokoll. Alla möss avlivades enligt AAALAC-standarder. 1. Beredning av immunceller från mjälten OBS: Avliva naiva möss med CO2 eutanasi. C57BL / 6 möss som köpts från Jackson Laboratories och avlats internt används för experiment vid 6-12 veckors ålder. Både manliga och kvinnliga möss används för experiment. Desinficera m…

Representative Results

Det experimentella arbetsflödet för att bedöma kalciumsvar i primära murina T-celler med användning av ett Indo-1-ratiometriskt färgämne med multiplexerande ytfläckar visas i figur 1. Efter skörd och bearbetning av mussplenocyterna till en enda cellsuspension färgas cellerna med en Indo-1 AM-ester och ytfärgas med fluorkrombundna antikroppar. När färgämnesladdningen och antikroppsfärgningen är klar värms lymfocytproverna upp till en biologisk temperatur (37 °C). Proverna an…

Discussion

Detta protokoll beskriver en optimerad analys utformad för att mäta kalciumsvar i primära murina T-celler laddade med titrerade Indo-1-ratiometriska indikatorfärgämne med fullspektrumflödescytometri ^7,8. Fördelen med att utföra kalciumflödesanalyser med fullspektrumflödescytometri är förmågan att multiplexera ytcellmarkörfärgning i kombination med bedömning av Indo-1-fluorescens. Fullspektrumflödescytometri har fördelen att tillåta användning …

Materials

12 well TC treated plates	Cell Treat	229111
50 mL conical	Greiner Bio1	41-12-17-03	50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap
5mL polysterene flow tubes	Corning	352052
5mL syringe	BD syringe	309646	plunger only is used sheith is discarded
70uM filter	Greiner bio1	542070
aCD3 (17A2)	Biolegend	100202
AKC lysis Buffer	Gibco	A1049201
Aurora Spectral Flowcytometer	https://cytekbio.com/pages/aurora
Bath Beads	coleparmer	Item # UX-06274-52
CD19 PE	Tonbo	50-0193-U100
CD1d Tetramer APC	NIH
CD25 PECy7	ebioscience	15-0251
CD4 APC Cy7	Tonbo	25-0042-U100
CD8a FITC	ebioscience	11-0081-85
Cell Incubator	Formal Scientific
Dissection Tools forceps	McKesson	#487593	Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth
Dissection Tools Scissors	McKesson	#970135	Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip
DPBS 1x	Gibco	14190-136	DPBS
EGTA	Fisher	NC1280093
FBS	Hyclond	SH30071.03	lot AE29165301
FlowJo Software	https://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dye	ebioscience	65-085-39	Calcium Loading Dye
ionomycin	Millipore	407951-1mg
Live/Dead Ghost 540	Tonbo	13-0879-T100
Microcentrifuge tubes 1.7mL	Light Labs	A-7001
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine	Gibco	10378-016
PRN694	Med Chem Express	Hy-12688
Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)	Tonbo	70-0161-M001	FC Block
RPMI	Gibco	1875093	+ phenol red
RPMI phenol free	Gibco	11835030	-phenol red
Table top centrifuge	Beckman Coulter	Allegra612
TCRβ PerCP Cy5.5	ebioscience	45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5	ebioscience	15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Pack		Product No: C06019	Includes Tripan
Vi-Cell Blu	Beckman Coulter
Waterbath	Fisher Brand Dry bath