Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.
Abstract
Das Darmepithel regeneriert sich alle 5-7 Tage und wird von der intestinalen Epithelstammzellpopulation (IESC) am Boden der Kryptenregion gesteuert. IESCs umfassen aktive Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Epithelzelltypen differenzieren, und ruhende Stammzellen, die im Falle einer Verletzung als Reservestammzellen dienen. Die Regeneration des Darmepithels wird durch die sich selbst erneuernden und differenzierenden Fähigkeiten dieser aktiven IESCs gesteuert. Darüber hinaus sind das Gleichgewicht der kryptalen Stammzellpopulation und der Erhalt der Stammzellnische essentiell für die Darmregeneration. Die Organoidkultur ist ein wichtiger und attraktiver Ansatz zur Untersuchung von Proteinen, Signalmolekülen und Umwelthinweisen, die das Überleben und die Funktionen von Stammzellen regulieren. Dieses Modell ist kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und manipulierbarer als Tiermodelle. Organoide ahmen auch die Mikroumgebung des Gewebes nach und sorgen für In-vivo-Relevanz . Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von Kolonkrypten, die Einbettung dieser isolierten Kryptzellen in ein dreidimensionales Gelmatrixsystem und die Kultivierung von Kryptenzellen zur Bildung von Kolonorganoiden, die zur Selbstorganisation, Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind. Dieses Modell ermöglicht es, die Umwelt zu manipulieren – bestimmte Proteine wie Claudin-7 auszuschalten, Signalwege zu aktivieren / deaktivieren usw. – um zu untersuchen, wie diese Effekte die Funktion von Kolonstammzellen beeinflussen. Insbesondere wurde die Rolle des Tight-Junction-Proteins Claudin-7 bei der Funktion von Kolonstammzellen untersucht. Claudin-7 ist wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase und Barrierefunktion und -integrität. Knockout von Claudin-7 bei Mäusen induziert einen entzündlichen Darmerkrankungs-ähnlichen Phänotyp, der Darmentzündungen, Epithelhyperplasie, Gewichtsverlust, Schleimhautgeschwüre, Epithelzellablösung und Adenome aufweist. Zuvor wurde berichtet, dass Claudin-7 für intestinale epitheliale Stammzellfunktionen im Dünndarm benötigt wird. In diesem Protokoll wird ein Kolon-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Rolle von Claudin-7 im Dickdarm zu untersuchen.
Introduction
Die intestinale Organoidkultur ist ein dreidimensionales (3D) ex vivo System, in dem Stammzellen aus den Darmkrypten des Primärgewebes isoliert und zu einer Gelmatrix 1,2 plattiert werden. Diese Stammzellen sind zur Selbsterneuerung, Selbstorganisation und Organfunktionalität fähig2. Organoide ahmen die Mikroumgebung des Gewebes nach und sind In-vivo-Modellen ähnlicher als zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle, obwohl sie weniger manipulierbar sind als Zellen 3,4. Dieses Modell beseitigt Hindernisse, die in 2D-Modellen auftreten, wie z. B. das Fehlen geeigneter Zell-Zell-Adhäsionen, Zell-Matrix-Interaktionen und homogener Populationen, und reduziert auch die Einschränkungen von Tiermodellen, einschließlich hoher Kosten und langer Zeiträume5. Darmorganoide – auch als Kolonoide für diejenigen bezeichnet, die aus Stammzellen der Kolonkrypta gezüchtet werden – sind im Wesentlichen Miniorgane, die ein Epithel enthalten, das alle Zelltypen enthält, die in vivo vorhanden wären, sowie ein Lumen. Dieses Modell ermöglicht die Manipulation des Systems, um viele Aspekte des Darms zu untersuchen, wie die Stammzellnische, Darmphysiologie, Pathophysiologie und Darmmorphogenese 3,5,6. Es bietet auch ein großartiges Modell für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung menschlicher Darmerkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs, patientenspezifische personalisierte Behandlungsentwicklung und die Untersuchung der Geweberegeneration 4,7,8,9. Darüber hinaus kann das Organoidsystem auch verwendet werden, um zelluläre Kommunikation, Arzneimittelmetabolismus, Lebensfähigkeit, Proliferation und Reaktion auf Reizezu untersuchen 7,8. Während Tiermodelle verwendet werden können, um potenzielle Therapeutika für intestinale pathologische Erkrankungen zu testen, sind sie ziemlich begrenzt, da die Untersuchung mehrerer Medikamente gleichzeitig eine Herausforderung darstellt. Es gibt mehr Störvariablen in vivo, und die damit verbundenen Kosten und Zeit sind hoch bzw. lang. Auf der anderen Seite ermöglicht das Organoidkultursystem das Screening vieler Therapeutika auf einmal in kürzerer Zeit und ermöglicht auch eine personalisierte Behandlung durch die Verwendung von patientenabgeleitetenOrganoidkulturen 4,8. Die Fähigkeit von Kolonorganoiden, Gewebeorganisation, Mikroumgebung und Funktionalität nachzuahmen, macht sie auch zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung von Regeneration und Gewebereparatur9. Unser Labor hat ein Dünndarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Wirkung von Claudin-7 auf die Funktionen von Dünndarmstammzellen zu untersuchen10. In dieser Studie wird ein Dickdarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Fähigkeit oder mangelnde Fähigkeit von Stammzellen zu untersuchen, sich selbst zu erneuern, zu differenzieren und sich in einem bedingten Claudin-7-Knockout-Modell (cKO) zu vermehren.
Claudin-7 ist ein sehr wichtiges Tight Junction (TJ)-Protein, das im Darm stark exprimiert wird und für die Aufrechterhaltung der TJ-Funktion und -Integrität unerlässlich ist11. cKO-Mäuse leiden an einem IBD-ähnlichen Phänotyp, der schwere Entzündungen, Ulzerationen, Epithelzellablagerungen, Adenome und erhöhte Zytokinspiegel aufweist11,12. Während allgemein anerkannt ist, dass Claudine für die epitheliale Barrierefunktion von entscheidender Bedeutung sind, entstehen neue Rollen für Clavine. Sie sind an Proliferation, Migration, Krebsprogression und Stammzellfunktion beteiligt 10,12,13,14,15,16,17. Derzeit ist nicht bekannt, wie sich Claudin-7 auf die Stammzellnische und die Funktion von Kolonstammzellen auswirkt. Da sich der Darm etwa alle 5-7 Tage schnell selbst erneuert, ist die Aufrechterhaltung der Stammzellnische und das ordnungsgemäße Funktionieren der aktiven Stammzellen von entscheidender Bedeutung18. Hier wird ein System etabliert, um die möglichen regulatorischen Effekte von Claudin-7 auf die Dickdarmstammzellnische zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoidkultur ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Stammzellfunktion, der Darmphysiologie, der Arzneimittelforschung, der menschlichen Darmerkrankungen sowie der Regeneration und Reparatur von Geweben 7,8,9,10,11,26. Obwohl es viele Vorteile hat, kann es schwierig sein, es zu etablieren. Vorsicht ist bei a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom NIH DK103166 finanziert.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
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