Трехмерная культура склепков толстой кишки мышей для изучения функции стволовых клеток кишечника Ex vivo
Summary
Настоящий протокол описывает создание органоидной системы толстой кишки для изучения активности и функционирования стволовых клеток толстой кишки в нокаут-модели клодина-7.
Abstract
Кишечный эпителий регенерирует каждые 5-7 дней и контролируется популяцией кишечных эпителиальных стволовых клеток (IESC), расположенной в нижней части области крипты. К КЭСК относятся активные стволовые клетки, которые самообновляются и дифференцируются в различные типы эпителиальных клеток, и покоящиеся стволовые клетки, которые служат резервными стволовыми клетками в случае травмы. Регенерация кишечного эпителия контролируется самообновляющимися и дифференцирующими возможностями этих активных ИЭСК. Кроме того, баланс популяции стволовых клеток крипты и поддержание ниши стволовых клеток имеют важное значение для регенерации кишечника. Органоидная культура является важным и привлекательным подходом к изучению белков, сигнальных молекул и сигналов окружающей среды, которые регулируют выживание и функции стволовых клеток. Эта модель дешевле, менее трудоемка и более манипулируема, чем модели животных. Органоиды также имитируют микроокружение тканей, обеспечивая актуальность in vivo . Настоящий протокол описывает изоляцию крипт толстой кишки, встраивание этих изолированных клеток крипты в трехмерную систему гелевой матрицы и культивирование клеток крипты с образованием органоидов толстой кишки, способных к самоорганизации, пролиферации, самообновлению и дифференцировке. Эта модель позволяет манипулировать окружающей средой, выбивая специфические белки, такие как клодин-7, активируя / деактивируя сигнальные пути и т. Д., Чтобы изучить, как эти эффекты влияют на функционирование стволовых клеток толстой кишки. В частности, была изучена роль белка плотного соединения claudin-7 в функции стволовых клеток толстой кишки. Клаудин-7 жизненно важен для поддержания кишечного гомеостаза и барьерной функции и целостности. Нокаут клавдина-7 у мышей вызывает воспалительный фенотип, подобный заболеванию кишечника, демонстрирующий воспаление кишечника, гиперплазию эпителия, потерю веса, изъязвления слизистой оболочки, шелушение эпителиальных клеток и аденомы. Ранее сообщалось, что клаудин-7 необходим для функций эпителиальных стволовых клеток кишечника в тонком кишечнике. В этом протоколе устанавливается система культуры толстой кишки для изучения роли клаудина-7 в толстой кишке.
Introduction
Кишечная органоидная культура представляет собой трехмерную (3D) систему ex vivo, в которой стволовые клетки выделяют из кишечных крипт первичной ткани и покрывают в гелевую матрицу 1,2. Эти стволовые клетки способны к самообновлению, самоорганизации и функциональности органа2. Органоиды имитируют микроокружение тканей и больше похожи на модели in vivo, чем на двумерные (2D) модели культур клеток in vitro, хотя и менее манипулируемы, чем клетки 3,4. Эта модель устраняет препятствия, встречающиеся в 2D-моделях, такие как отсутствие надлежащих клеточно-клеточных спаек, клеточно-матричных взаимодействий и однородных популяций, а также уменьшает ограничения животных моделей, включая высокие затраты и длительные периоды времени5. Кишечные органоиды, также называемые колоноидами для тех, которые выращены из стволовых клеток, полученных из крипты толстой кишки, по существу являются мини-органами, которые содержат эпителий, включая все типы клеток, которые будут присутствовать in vivo, а также просвет. Эта модель позволяет манипулировать системой для изучения многих аспектов кишечника, таких как ниша стволовых клеток, физиология кишечника, патофизиология и морфогенез кишечника 3,5,6. Он также предоставляет отличную модель для открытия лекарств, изучения кишечных расстройств человека, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) и колоректальный рак, разработки персонализированного лечения для конкретного пациента и изучения регенерации тканей 4,7,8,9. Кроме того, органоидная система также может быть использована для изучения клеточной связи, метаболизма лекарств, жизнеспособности, пролиферации и ответа на стимулы 7,8. Хотя животные модели могут быть использованы для тестирования потенциальных терапевтических средств для кишечных патологических состояний, они довольно ограничены, поскольку изучение нескольких лекарств одновременно представляет собой проблему. Существует больше смешанных переменных in vivo, и связанные с ними затраты и время являются высокими и длинными, соответственно. С другой стороны, система органоидных культур позволяет проводить скрининг многих терапевтических средств одновременно за более короткий период времени, а также позволяет персонализировать лечение путем использования органоидной культуры, полученной от пациента 4,8. Способность органоидов толстой кишки имитировать организацию тканей, микроокружение и функциональность также делает их отличной моделью для изучения регенерации и восстановления тканей9. Наша лаборатория создала систему органоидных культур тонкой кишки для изучения влияния клаудина-7 на функции стволовых клеток тонкой кишки10. В этом исследовании установлена система культур органоидов толстого кишечника для изучения способности или отсутствия способности стволовых клеток к самообновлению, дифференцировке и пролиферации в условной модели нокаута claudin-7 (cKO).
Клодин-7 является очень важным белком плотного соединения (TJ), который высоко экспрессируется в кишечнике и необходим для поддержания функции и целостности TJ11. Мыши cKO страдают от фенотипа, подобного IBD, проявляя сильное воспаление, изъязвления, шелушение эпителиальных клеток, аденомы и повышенные уровни цитокинов11,12. Хотя широко признано, что клаудины жизненно важны для функции эпителиального барьера, появляются новые роли для клаудинов; они участвуют в пролиферации, миграции, прогрессировании рака и функции стволовых клеток 10,12,13,14,15,16,17. В настоящее время неизвестно, как клодин-7 влияет на нишу стволовых клеток и функцию стволовых клеток толстой кишки. Поскольку кишечник быстро самообновляется примерно каждые 5-7 дней, поддержание ниши стволовых клеток и правильное функционирование активных стволовых клеток имеет жизненно важное значение18. Здесь создана система для изучения потенциальных регуляторных эффектов клаудина-7 на нишу стволовых клеток толстой кишки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Органоидная культура является отличной моделью для изучения функции стволовых клеток, физиологии кишечника, открытия лекарств, кишечных заболеваний человека, атакже регенерации и восстановления тканей 7,8,9,10,11,26</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
