Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Summary

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Abstract

El epitelio intestinal se regenera cada 5-7 días, y es controlado por la población de células madre epiteliales intestinales (IESC) ubicada en la parte inferior de la región de la cripta. Las IESC incluyen células madre activas, que se autorrenuevan y se diferencian en varios tipos de células epiteliales, y células madre quiescentes, que sirven como células madre de reserva en caso de lesión. La regeneración del epitelio intestinal está controlada por las capacidades autorrenovadoras y diferenciadoras de estos IESC activos. Además, el equilibrio de la población de células madre de la cripta y el mantenimiento del nicho de células madre son esenciales para la regeneración intestinal. El cultivo de organoides es un enfoque importante y atractivo para estudiar proteínas, moléculas de señalización y señales ambientales que regulan la supervivencia y las funciones de las células madre. Este modelo es menos costoso, consume menos tiempo y es más manipulable que los modelos animales. Los organoides también imitan el microambiente tisular, proporcionando relevancia in vivo . El presente protocolo describe el aislamiento de criptas colónicas, incrustando estas células de cripta aisladas en un sistema de matriz de gel tridimensional y cultivando células de cripta para formar organoides colónicos capaces de autoorganización, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Este modelo permite manipular el entorno, eliminando proteínas específicas como la claudina-7, activando / desactivando las vías de señalización, etc., para estudiar cómo estos efectos influyen en el funcionamiento de las células madre del colon. Específicamente, se examinó el papel de la proteína de unión estrecha claudina-7 en la función de las células madre del colon. Claudina-7 es vital para mantener la homeostasis intestinal y la función e integridad de barrera. La eliminación de claudina-7 en ratones induce un fenotipo similar a la enfermedad inflamatoria intestinal que exhibe inflamación intestinal, hiperplasia epitelial, pérdida de peso, ulceraciones de la mucosa, desprendimiento de células epiteliales y adenomas. Anteriormente, se informó que la claudina-7 es necesaria para las funciones de las células madre epiteliales intestinales en el intestino delgado. En este protocolo, se establece un sistema de cultivo de organoides colónicos para estudiar el papel de la claudina-7 en el intestino grueso.

Introduction

El cultivo de organoides intestinales es un sistema tridimensional (3D) ex vivo en el que las células madre se aíslan de las criptas intestinales del tejido primario y se colocan en una matriz de gel ^1,2. Estas células madre son capaces de autorrenovación, autoorganización y funcionalidad de órganos². Los organoides imitan el microambiente tisular y son más similares a los modelos in vivo que a los modelos de cultivo celular in vitro bidimensionales (2D), aunque menos manipulables que las células ^3,4. Este modelo elimina los obstáculos encontrados en los modelos 2D, como la falta de adherencias adecuadas célula-célula, interacciones célula-matriz y poblaciones homogéneas, y también reduce las limitaciones de los modelos animales, incluidos los altos costos y los largos períodos de tiempo⁵. Los organoides intestinales, también conocidos como colonoides para aquellos cultivados a partir de células madre derivadas de criptas colónicas, son esencialmente miniórganos que contienen un epitelio que incluye todos los tipos de células que estarían presentes in vivo, así como un lumen. Este modelo permite la manipulación del sistema para estudiar muchos aspectos del intestino, como el nicho de células madre, la fisiología intestinal, la fisiopatología y la morfogénesis intestinal ^3,5,6. También proporciona un gran modelo para el descubrimiento de fármacos, estudiando trastornos intestinales humanos como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y el cáncer colorrectal, el desarrollo de tratamientos personalizados específicos para el paciente y el estudio de la regeneración de tejidos 4,7,8,9. Además, el sistema organoide también puede ser utilizado para estudiar la comunicación celular, el metabolismo de los fármacos, la viabilidad, la proliferación y la respuesta a estímulos ^7,8. Si bien los modelos animales pueden usarse para probar terapias potenciales para afecciones patológicas intestinales, son bastante limitados, ya que estudiar múltiples medicamentos a la vez plantea un desafío. Hay más variables de confusión in vivo, y el costo y el tiempo asociados son altos y largos, respectivamente. Por otro lado, el sistema de cultivo de organoides permite el cribado de muchas terapias a la vez en un período de tiempo más corto y también permite el tratamiento personalizado mediante el uso del cultivo de organoides derivado del paciente ^4,8. La capacidad de los organoides colónicos para imitar la organización tisular, el microambiente y la funcionalidad también los convierte en un excelente modelo para estudiar la regeneración y la reparación de tejidos⁹. Nuestro laboratorio ha establecido un sistema de cultivo de organoides del intestino delgado para estudiar el efecto de la claudina-7 en las funciones de las células madre del intestino delgado¹⁰. En este estudio, se establece un sistema de cultivo de organoides del intestino grande para estudiar la capacidad o falta de capacidad de las células madre para autorrenovarse, diferenciarse y proliferar en un modelo de knockout condicional de claudina-7 (cKO).

La claudina-7 es una proteína de unión estrecha (TJ) muy importante que se expresa altamente en el intestino y es esencial para mantener la función e integridad de TJ¹¹. Los ratones cKO sufren de un fenotipo similar a la EII, exhibiendo inflamación severa, ulceraciones, desprendimiento de células epiteliales, adenomas y aumento de los niveles de citoquinas^11,12. Si bien es ampliamente aceptado que las claudinas son vitales para la función de barrera epitelial, están surgiendo nuevos roles para las claudinas; Están involucrados en la proliferación, migración, progresión del cáncer y función de las células madre 10,12,13,14,15,16,17. Actualmente se desconoce cómo la claudina-7 afecta el nicho de células madre y la función de las células madre del colon. Como el intestino se renueva rápidamente aproximadamente cada 5-7 días, el mantenimiento del nicho de células madre y el funcionamiento adecuado de las células madre activas es vital¹⁸. Aquí, se establece un sistema para examinar los posibles efectos reguladores de la claudina-7 en el nicho de células madre del colon.

Protocol

Todos los experimentos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Este (ECU) y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y ECU sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se generaron ratones knockout de claudina-7 específicos intestinales inducibles cruzando ratones transgénicos C57BL6 claudina-7-flox con ratones Villin-CreERT219. En este estudio se utili…

Representative Results

Con el fin de examinar los efectos reguladores de la claudina-7 en las células madre del colon, se aislaron criptas colónicas del tejido murino del colon como se describió anteriormente y se muestra en la Figura 1A. Una vez que las criptas se aislaron del tejido primario, se colocaron en una matriz 3D en una placa de 96 pocillos para crecer durante 11 días (Figura 1). Las criptas sanas normales cerrarán la luz y se convertirán en esferoides para el día 2 …

Discussion

El cultivo de organoides es un excelente modelo para estudiar la función de las células madre, la fisiología intestinal, el descubrimiento de fármacos, las enfermedades intestinales humanas y la regeneración y reparación de tejidos 7,8,9,10,11,26. Si bien tiene muchas ventajas, puede ser difícil de establecer. Se debe …

Materials

0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254