Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo
Summary
Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.
Abstract
Bağırsak epiteli her 5-7 günde bir yenilenir ve kript bölgesinin dibinde bulunan bağırsak epitel kök hücre (IESC) popülasyonu tarafından kontrol edilir. IESC’ler, kendini yenileyen ve çeşitli epitel hücre tiplerine farklılaşan aktif kök hücreleri ve yaralanma durumunda yedek kök hücre görevi gören sessiz kök hücreleri içerir. Bağırsak epitelinin yenilenmesi, bu aktif IESC’lerin kendini yenileyen ve farklılaştıran yetenekleri ile kontrol edilir. Ek olarak, kript kök hücre popülasyonunun dengesi ve kök hücre nişinin korunması, bağırsak yenilenmesi için gereklidir. Organoid kültür, kök hücre sağkalımını ve işlevlerini düzenleyen proteinleri, sinyal moleküllerini ve çevresel ipuçlarını incelemek için önemli ve çekici bir yaklaşımdır. Bu model, hayvan modellerinden daha ucuz, daha az zaman alıcı ve daha manipüle edilebilir. Organoidler ayrıca doku mikro ortamını taklit ederek in vivo alaka düzeyi sağlar. Mevcut protokol, kolonik kriptlerin izolasyonunu, bu izole edilmiş kript hücrelerini üç boyutlu bir jel matris sistemine gömmeyi ve kendi kendini organize etme, çoğalma, kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahip kolonik organoidler oluşturmak için kript hücrelerini kültürlemeyi açıklamaktadır. Bu model, bu etkilerin kolonik kök hücrelerin işleyişini nasıl etkilediğini incelemek için claudin-7 gibi spesifik proteinleri nakavt eden, sinyal yollarını aktive eden / devre dışı bırakan vb. Spesifik olarak, sıkı birleşim proteini claudin-7’nin kolonik kök hücre fonksiyonundaki rolü incelenmiştir. Claudin-7, bağırsak homeostazı ve bariyer fonksiyonunu ve bütünlüğünü korumak için hayati öneme sahiptir. Farelerde klodin-7’nin nakavtı, bağırsak iltihabı, epitel hiperplazisi, kilo kaybı, mukozal ülserasyonlar, epitel hücre dökülmesi ve adenomlar sergileyen inflamatuar bağırsak hastalığı benzeri bir fenotipe neden olur. Daha önce, ince bağırsakta bağırsak epitel kök hücre fonksiyonları için claudin-7’nin gerekli olduğu bildirilmiştir. Bu protokolde, claudin-7’nin kalın bağırsaktaki rolünü incelemek için kolonik bir organoid kültür sistemi kurulmuştur.
Introduction
Bağırsak organoid kültürü, kök hücrelerin birincil dokunun bağırsak kriptlerinden izole edildiği ve bir jel matrisi 1,2’ye kaplandığı üç boyutlu (3D) bir ex vivo sistemdir. Bu kök hücreler kendini yenileme, kendi kendini organize etme ve organ işlevselliği yeteneğine sahiptir2. Organoidler doku mikro ortamını taklit eder ve in vivo modellere iki boyutlu (2D) in vitro hücre kültürü modellerinden daha benzerdir, ancak hücrelerden daha az manipüle edilebilir 3,4. Bu model, uygun hücre-hücre yapışmaları, hücre-matris etkileşimleri ve homojen popülasyonların eksikliği gibi 2B modellerde karşılaşılan engelleri ortadan kaldırır ve ayrıca yüksek maliyetler ve uzun zaman dilimleri de dahil olmak üzere hayvan modellerinin sınırlamalarını azaltır5. Bağırsak organoidleri – kolonik kript kaynaklı kök hücrelerden yetiştirilenler için kolonoidler olarak da adlandırılır – esasen in vivo olarak mevcut olabilecek tüm hücre tiplerini ve bir lümeni içeren bir epitel içeren mini organlardır. Bu model, kök hücre nişi, bağırsak fizyolojisi, patofizyolojisi ve bağırsak morfogenezi 3,5,6 gibi bağırsağın birçok yönünü incelemek için sistemin manipülasyonuna izin verir. Ayrıca, enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal kanser gibi insan bağırsak bozukluklarını inceleyen, hastaya özgü kişiselleştirilmiş tedavi gelişimini ve doku rejenerasyonunu inceleyen ilaç keşfi için harika bir model sağlar 4,7,8,9. Ek olarak, organoid sistem hücresel iletişimi, ilaç metabolizmasını, canlılığı, çoğalmayı ve uyaranlara verilen cevabı incelemek için de kullanılabilir 7,8. Hayvan modelleri, bağırsak patolojik koşulları için potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilse de, aynı anda birden fazla ilacı incelemek bir zorluk oluşturduğundan oldukça sınırlıdır. İn vivo olarak daha kafa karıştırıcı değişkenler vardır ve ilişkili maliyet ve zaman sırasıyla yüksek ve uzundur. Öte yandan, organoid kültür sistemi, birçok terapötikin aynı anda daha kısa sürede taranmasına izin verir ve ayrıca hasta kaynaklı organoid kültürün kullanımı yoluyla kişiselleştirilmiş tedaviye olanak tanır 4,8. Kolonik organoidlerin doku organizasyonunu, mikro çevreyi ve işlevselliği taklit etme yeteneği, onları rejenerasyon ve doku onarımını incelemek için mükemmel bir model haline getirir9. Laboratuvarımız claudin-7’nin ince bağırsak kök hücre fonksiyonları üzerindeki etkisini incelemek için ince bağırsak organoid kültür sistemi kurmuştur10. Bu çalışmada, kök hücrelerin koşullu klodin-7 nakavt (cKO) modelinde kendini yenileme, farklılaştırma ve çoğalma yeteneğini veya yetenek eksikliğini incelemek için kalın bağırsak organoid kültür sistemi kurulmuştur.
Claudin-7, bağırsakta yüksek oranda eksprese edilen ve TJ fonksiyonunu ve bütünlüğünü korumak için gerekli olan çok önemli bir sıkı bağlantı (TJ) proteinidir11. cKO fareleri, şiddetli inflamasyon, ülserasyonlar, epitel hücre kayması, adenomlar ve artmış sitokin seviyeleri11,12 sergileyen IBD benzeri bir fenotipten muzdariptir. Claudins’in epitel bariyer fonksiyonu için hayati önem taşıdığı yaygın olarak kabul edilirken, claudins için yeni roller ortaya çıkmaktadır; proliferasyon, göç, kanser progresyonu ve kök hücre fonksiyonu 10,12,13,14,15,16,17 ile ilgilidirler. Claudin-7’nin kök hücre nişini ve kolonik kök hücrelerin işlevini nasıl etkilediği şu anda bilinmemektedir. Bağırsak yaklaşık her 5-7 günde bir hızla kendini yenilediğinden, kök hücre nişinin korunması ve aktif kök hücrelerin düzgün çalışması hayati önem taşır18. Burada, claudin-7’nin kolonik kök hücre nişi üzerindeki potansiyel düzenleyici etkilerini incelemek için bir sistem kurulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoid kültür, kök hücre fonksiyonunu, bağırsak fizyolojisini, ilaç keşfini, insan bağırsak hastalıklarını ve doku yenilenmesini incelemek ve onarmak için mükemmel bir modeldir 7,8,9,10,11,26. Birçok avantajı olsa da, kurulması zor olabilir. Protokol boyunca tüm adımlarda, ancak en önemlisi kaplama aşa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH DK103166 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
