आंतों के स्टेम सेल फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए मुराइन कोलोनिक क्रिप्ट्स की त्रि-आयामी संस्कृति
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक क्लॉडिन -7 नॉकआउट मॉडल में कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं की गतिविधि और कामकाज का अध्ययन करने के लिए एक मुराइन कोलोनिक ऑर्गेनॉइड सिस्टम स्थापित करने का वर्णन करता है।
Abstract
आंतों का एपिथेलियम हर 5-7 दिनों में पुनर्जीवित होता है, और क्रिप्ट क्षेत्र के तल पर स्थित आंतों के उपकला स्टेम सेल (आईईएससी) आबादी द्वारा नियंत्रित होता है। आईईएससी में सक्रिय स्टेम सेल शामिल हैं, जो विभिन्न उपकला कोशिका प्रकारों में आत्म-नवीनीकरण और अंतर करते हैं, और क्विसेंट स्टेम सेल, जो चोट के मामले में आरक्षित स्टेम कोशिकाओं के रूप में काम करते हैं। आंतों के उपकला का पुनर्जनन इन सक्रिय आईईएससी की आत्म-नवीनीकरण और विभेदक क्षमताओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, क्रिप्ट स्टेम सेल आबादी का संतुलन और आंतों के उत्थान के लिए स्टेम सेल आला का रखरखाव आवश्यक है। ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रोटीन, सिग्नलिंग अणुओं और पर्यावरणीय संकेतों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण और आकर्षक दृष्टिकोण है जो स्टेम सेल अस्तित्व और कार्यों को नियंत्रित करता है। यह मॉडल पशु मॉडल की तुलना में कम महंगा, कम समय लेने वाला और अधिक मैनिपुलेटेबल है। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल भी करते हैं, जो विवो प्रासंगिकता प्रदान करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल कोलोनिक क्रिप्ट्स के अलगाव का वर्णन करता है, इन पृथक क्रिप्ट कोशिकाओं को तीन आयामी जेल मैट्रिक्स सिस्टम में एम्बेड करता है और स्व-संगठन, प्रसार, आत्म-नवीकरण और भेदभाव में सक्षम कोलोनिक ऑर्गेनोइड बनाने के लिए क्रिप्ट कोशिकाओं की खेती करता है। यह मॉडल किसी को पर्यावरण-दस्तक देने वाले विशिष्ट प्रोटीन जैसे क्लाउडिन -7, सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय / निष्क्रिय करने आदि में हेरफेर करने की अनुमति देता है – यह अध्ययन करने के लिए कि ये प्रभाव कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कामकाज को कैसे प्रभावित करते हैं। विशेष रूप से, कोलोनिक स्टेम सेल फ़ंक्शन में तंग जंक्शन प्रोटीन क्लॉडिन -7 की भूमिका की जांच की गई थी। क्लॉडिन -7 आंतों के होमियोस्टैसिस और बाधा कार्य और अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में क्लॉडिन -7 का नॉकआउट आंतों की सूजन, उपकला हाइपरप्लासिया, वजन घटाने, म्यूकोसल अल्सरेशन, उपकला कोशिका सूजन और एडेनोमा का प्रदर्शन करने वाले सूजन आंत्र रोग जैसे फेनोटाइप को प्रेरित करता है। इससे पहले, यह बताया गया था कि छोटी आंत में आंतों के उपकला स्टेम सेल कार्यों के लिए क्लॉडिन -7 की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, बड़ी आंत में क्लॉडिन -7 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक कोलोनिक ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापित किया गया है।
Introduction
आंतों के ऑर्गेनॉइड कल्चर एक त्रि-आयामी (3 डी) एक्स विवो सिस्टम है जिसमें स्टेम कोशिकाओं को प्राथमिक ऊतक के आंतों के क्रिप्ट से अलग किया जाता है और जेल मैट्रिक्स 1,2 में चढ़ाया जाता है। ये स्टेम सेल आत्म-नवीकरण, आत्म-संगठन और अंग कार्यक्षमतामें सक्षम हैं। ऑर्गेनोइड्स ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करते हैं और विट्रो सेल कल्चर मॉडल में दो-आयामी (2 डी) की तुलना में विवो मॉडल में अधिक समान होते हैं, हालांकि कोशिकाओं 3,4 की तुलना में कम मैनिपुलेटेबल होते हैं। यह मॉडल 2 डी मॉडल में आने वाली बाधाओं को समाप्त करता है, जैसे कि उचित सेल-सेल आसंजन, सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन और समरूप आबादी की कमी, और पशु मॉडल की सीमाओं को भी कम करता है, जिसमें उच्च लागत और समय की लंबी अवधिशामिल है। आंतों के ऑर्गेनोइड्स – जिन्हें कोलोनिक क्रिप्ट-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं से उगाए गए लोगों के लिए कोलोनोइड्स के रूप में भी जाना जाता है- अनिवार्य रूप से मिनी-अंग होते हैं जिनमें सभी सेल प्रकारों सहित एक उपकला होती है जो विवो में मौजूद होगी, साथ ही साथ एक लुमेन भी। यह मॉडल आंत के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए सिस्टम के हेरफेर की अनुमति देता है, जैसे कि स्टेम सेल आला, आंतों के शरीर विज्ञान, पैथोफिज़ियोलॉजी, और आंत मोर्फोजेनेसिस 3,5,6। यह दवा की खोज के लिए एक महान मॉडल भी प्रदान करता है, मानव आंतों के विकारों जैसे सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) और कोलोरेक्टल कैंसर, रोगी-विशिष्ट व्यक्तिगत उपचार विकास और ऊतक पुनर्जनन 4,7,8,9 का अध्ययन करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड सिस्टम का उपयोग सेलुलर संचार, दवा चयापचय, व्यवहार्यता, प्रसार औरउत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। जबकि पशु मॉडल का उपयोग आंतों की पैथोलॉजिकल स्थितियों के लिए संभावित चिकित्सीय का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, वे काफी सीमित हैं, क्योंकि एक बार में कई दवाओं का अध्ययन करना एक चुनौती है। विवो में अधिक भ्रामक चर हैं, और संबंधित लागत और समय क्रमशः उच्च और लंबे हैं। दूसरी ओर, ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम कम समय अवधि में एक बार में कई चिकित्सीय की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है और रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड कल्चर 4,8 के उपयोग के माध्यम से व्यक्तिगत उपचार की भी अनुमति देता है। ऊतक संगठन, माइक्रोएन्वायरमेंट और कार्यक्षमता की नकल करने के लिए कोलोनिक ऑर्गेनोइड्स की क्षमता भी उन्हें पुनर्जनन औरऊतक की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है। हमारी प्रयोगशाला ने छोटी आंत स्टेम सेल कार्यों 10 पर क्लॉडिन -7 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक छोटी आंत ऑर्गेनॉइड कल्चर सिस्टम स्थापितकिया है। इस अध्ययन में, स्टेम कोशिकाओं की क्षमता, या क्षमता की कमी का अध्ययन करने के लिए एक बड़ी आंतों की ऑर्गेनॉइड संस्कृति प्रणाली स्थापित की गई है, जो सशर्त क्लॉडिन -7 नॉकआउट (सीकेओ) मॉडल में आत्म-नवीनीकरण, अंतर और प्रसार के लिए है।
क्लॉडिन -7 एक बहुत ही महत्वपूर्ण तंग जंक्शन (टीजे) प्रोटीन है जो आंत में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और टीजे फ़ंक्शन और अखंडताको बनाए रखने के लिए आवश्यक है। सीकेओ चूहे आईबीडी जैसे फेनोटाइप से पीड़ित हैं, जो गंभीर सूजन, अल्सरेशन, उपकला कोशिका स्लॉइंग, एडेनोमा और साइटोकिन स्तर11,12 में वृद्धि का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि क्लैडिन उपकला बाधा समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्लॉडिन के लिए नई भूमिकाएं उभर रही हैं; वे प्रसार, प्रवासन, कैंसर की प्रगति और स्टेम सेल फ़ंक्शन 10,12,13,14,15,16,17 में शामिल हैं। वर्तमान में यह अज्ञात है कि क्लॉडिन -7 स्टेम सेल आला और कोलोनिक स्टेम कोशिकाओं के कार्य को कैसे प्रभावित करता है। चूंकि आंत लगभग हर 5-7 दिनों में तेजी से स्व-नवीनीकरण करती है, स्टेम सेल आला का रखरखाव और सक्रिय स्टेम कोशिकाओं का उचितकार्य महत्वपूर्ण है। यहां, कोलोनिक स्टेम सेल आला पर क्लॉडिन -7 के संभावित नियामक प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रणाली स्थापित की गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑर्गेनॉइड कल्चर स्टेम सेल फ़ंक्शन, आंतों के शरीर विज्ञान, दवा की खोज, मानव आंतों के रोगों और ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत 7,8,9,10,11,26 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को एनआईएच डीके 103166 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
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