Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins

Lifang Yu; Yadan Zhang; Mario  Andrea Marchisio

doi:10.3791/64539

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Bioengineering

基于CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白的基因数字电路

Published: October 18, 2022

doi:

10.3791/64539

Lifang Yu*¹, Yadan Zhang*¹, Mario Andrea Marchisio

¹School of Pharmaceutical Science and Technology,Tianjin University

Summary

CRISPR-Cas系统和抗CRISPR蛋白被整合到 酿酒酵母的布尔门方案中。新的小逻辑电路表现出良好的性能，加深了对基于dCas9/dCas12a的转录因子和抗CRISPR蛋白性质的理解。

Abstract

合成基因布尔门和数字电路具有广泛的应用，从医疗诊断到环境保护。CRISPR-Cas系统及其天然抑制剂——抗CRISPR蛋白（Acrs）的发现为设计和实施体内基因数字电路提供了一种新工具。在这里，我们描述了一种协议，该协议遵循“设计-构建-测试-学习”生物工程循环的思想，并利用dCas9 / dCas12a及其相应的Acrs来建立小型转录网络，其中一些行为类似于 酿酒酵母中的布尔门。这些结果指出了dCas9/dCas12a作为转录因子的性质。特别是，为了实现基因表达的最大激活，dSpCas9需要与收集VP64激活域（AD）多个拷贝的工程支架RNA相互作用。相比之下，dCas12a应在C末端与强VP64-p65-RTA （VPR） AD融合。此外，两种Cas蛋白的活性不会通过增加细胞中sgRNA / crRNA的量来增强。本文还解释了如何基于CRISPR-dCas-Acr相互作用构建布尔门。人雌激素受体的 AcrIIA4 融合激素结合结构域是对 β-雌二醇有反应的 NOT 门的核心，而由诱导性 GAL1 启动子合成的 AcrVA 允许以半乳糖作为输入来模拟 YES 和 NOT 门。在后一个电路中，AcrVA5与dLbCas12a一起表现出最佳的逻辑行为。

Introduction

2011年，研究人员提出了一种计算方法，并开发了相应的软件，用于数字合成^{基因电路的}自动设计1。用户必须指定输入数量（三个或四个）并填写电路真值表;这提供了使用电子技术推导电路结构的所有必要信息。真值表通过 Karnaugh 映射方法² 转换为两个布尔公式。每个布尔公式都由描述电路输入（部分）之间的逻辑运算（和或乘法）及其否定（文字）的子句组成。子句依次相加（OR）或乘法（AND）以计算电路输出。每个电路都可以根据其两个相应的公式中的任何一个来实现：一个以POS（总和乘积）形式编写，另一个以SOP（产品总和）表示形式编写。前者由包含文字逻辑和的子句（即布尔门）的乘法组成。相比之下，后者是文字相乘的子句的总和。

电路可以在面包板上通过将不同的门物理连接在一起来实现。电流允许门之间交换信号，从而计算输出。

在生物学中，情况更为复杂。布尔门可以实现为转录单元（TU;即真核细胞内的序列“启动子编码区域终止子”），其中转录或翻译（或两者）受到调节。因此，至少有两种分子建立了生物线路：转录因子蛋白和非编码、反义RNA^。

基因数字电路被组织成两层或三层门，即：1）输入层，由YES（缓冲器）和NOT门组成，并将输入化学物质转换为布线分子;2）内层，它由与相应布尔公式中的子句一样多的 TU 组成。如果电路按照SOP公式设计，则内层中的每个子句都将在所谓的分布式输出架构中产生电路输出（例如荧光）。如果使用和积（POS）公式，则需要3）最后一层，它将包含一个从内层收集布线分子的乘法门。

总体而言，在合成生物学中，可以为同一电路设计许多不同的方案。它们在TU和连接分子的数量和种类上有所不同。为了选择在酵母细胞中实现的最简单解决方案，每个电路设计都与复杂性评分S相关联，定义为

其中 A 代表激活剂的数量， R 代表阻遏剂的数量， a 是反义RNA分子的数量。如果电路中没有激活剂或抑制因子，则它们对S的贡献为零。因此，当需要大量正交转录因子时，在实验室中实现电路方案（高S）更加困难。这意味着新的活化器和抑制器应重新设计，以实现数字电路内部的完整布线。原则上，可以使用锌指蛋白³ 和TAL效应^子4 作为模板来组装新型DNA结合蛋白。但是，此选项似乎过于艰巨和耗时;因此，人们应该主要依靠小RNA和翻译调控来完成复杂的基因回路。

最初，这种方法是为了在细菌中制造数字电路而开发的。事实上，在真核细胞中，比起反义RNA，更适合谈论microRNA（miRNA）或小干扰RNA（siRNA）⁵。然而，RNAi途径不存在于 酿酒酵母中。因此，应该选择完全转录网络。假设一个电路需要五个激活器和五个抑制器;其复杂性分数为 S = 32。通过将10个转录因子替换为融合到激活域（AD）的单个dCas9⁶ （核酸酶缺陷型Cas9），可以降低电路复杂性。如⁷所示，当在TATA盒和TSS（转录起始位点）之间结合启动子时，dCas9-AD在酵母中充当阻遏剂，当在TATA盒上游结合时，作为激活剂起作用。因此，可以用单个dCas9-AD融合蛋白和10个sgRNA（单个向导RNA）替换10个转录因子，总复杂性得分为S = 11。合成十种sgRNA既快速又容易，而如前所述，组装10种蛋白质需要更长、更复杂的工作。

或者，可以使用两种正交的dCas蛋白（例如dCas9和dCas12a）：一种融合到AD，另一种裸露或与抑制结构域组合。复杂度分数只会增加一个单位（S = 12）。因此，CRISPR-dCas系统是 酿酒酵母中构建非常复杂的基因数字电路的关键。

本文深入表征了酵母中基于dCas9和dCas12a的阻遏剂和激活剂的效率。结果表明，它们不需要大量的sgRNA来优化其活性，因此优先避免使用游离体质粒。此外，当使用募集VP64 AD拷贝的支架RNA（scRNA）时，基于dCas9的激活剂更有效。相比之下，dCas12a在直接融合到强VPR AD时效果很好。此外，根据激活剂的配置，合成活化启动子需要可变数量的靶位点（例如，使用 dCas12a-VPR 时为 3 个，dCas9-VP64 为 6 个，dCas9 和 scRNA 时只有一个）。作为阻遏因子，dCas12a在结合编码区而不是启动子时显得更敏锐。

然而，作为一个缺点，CRISPR-dCas9 / dCas12a不直接与化学物质相互作用。因此，它们在输入图层中可能没有用处。出于这个原因，已经研究了含有抗CRISPR蛋白（Acrs）的替代布尔门设计。Acrs作用于（d）Cas蛋白并抑制其工作⁸。因此，它们是调节CRISPR-（d）Cas系统活性的一种手段。本文深入分析了酿酒酵母II型Acrs与（d）Cas9以及V型Acrs和（d）Cas12a之间的相互作用。由于Acrs比Cas蛋白小得多，因此通过将人雌激素受体9-HBD（hER）的激素结合结构域融合到AcrIIA4，构建了对雌激素β-雌二醇有反应的NOT门。此外，在用半乳糖诱导时实现了少数表达dCas12a（-AD）的YES和NOT门和AcrVAs。目前，这些门仅用作概念证明。然而，它们也代表了深入重新思考算法的第一步，以执行酵母细胞中合成基因数字电路的计算自动设计。

Protocol

1. sgRNA/crRNA表达盒的设计与构建注意：有两种sgRNA / crRNA表达盒：一种称为SNR5210-由RNA聚合酶III依赖性SNR52启动子，sgRNA / crRNA序列和SUP4终止子组成;另一个缩写为RGR11由RNA聚合酶II依赖性ADH1启动子，RGR（核酶引导RNA-核酶）结构组成，其中包含两个核酶（锤头核酶-HH和肝炎δ病毒核酶-HDV）和介于两者之间的sgRNA/crRNA序列?…

Representative Results

通过RNA聚合酶III型启动子表达sgRNA/crRNA首先，这项工作解决了图1A所示的转录激活电路（电路1）的工程设计。它包含三个基本组成部分：1）编码yEGFP的基因（报告基因），其之前是一系列不同的合成启动子，为dCas9 / dCas12a-AD提供靶位点;2）酵母密码子优化版本的dCas9或dCas12a融合到激活域（分别为VP64和VPR），并包含一个或两个核定位序列（NLS）。两种dCas蛋白均…

Discussion

该协议显示了合成基因数字电路可能的完整工作流程，遵循“设计-构建-测试-学习”（DBTL）生物工程周期，涉及干实验室和湿实验室实验。在这里，我们专注于CRISPR-Cas系统，主要是dSpCas9，denAsCas12a，dLbCas12a和相应的抗CRISPR蛋白，通过在 酿酒酵母 中设计和构建小转录网络。其中一些模仿布尔门，布尔门是数字电路的基本组件。这里描述的所有回路都允许我们描述酿 酒酵母中CRISPR相?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们要感谢TJU合成生物学实验室-SPST的所有学生的帮助，以及李智和张向阳在FACS实验中的帮助。

Materials

0.1 mL PCR 8-strip tubes	NEST	403112
0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-C
15 mL Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C
50 mL Centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011500
Agarose-molecular biology grade	Invitrogen	75510-019
Ampicillin sodium salt	Solarbio	69-52-3
Applied biosystems veriti 96-well thermal cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786
AxyPrep DNA gel extraction kit	Axygen	AP-GX-250
BD FACSuite CS&T research beads	BD	650621	Fluorescent beads
BD FACSVerse flow cytometer	BD	–
Centrifuge	Eppendorf	5424
Centrifuge Sorvall ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380
E. coli competent cells (Strain DH5α)	Life Technologies	18263-012
ECL select Western Blotting detection reagent	GE Healthcare	RPN2235
Electrophoresis apparatus	Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd	JY300C
Flat 8-strip caps	NEST	406012
Gene synthesis company	Azenta Life Sciences		https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences
Goat anti-Mouse IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11004
HiFiScript cDNA synthesis kit	CWBIO	CW2569M	Kit used in step 6.2.2.1
Lysate solution (Zymolyase)	zymoresearch	E1004-A
Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope	Nikon	–	Fluorescence microscope
Pipet tips—10 μL	Axygen	T-300-R-S
Pipet tips—1000 μL	Axygen	T-1000-B-R-S
Pipet tips—200 μL	Axygen	T-200-Y-R-S
pRSII403	Addgene	35436
pRSII404	Addgene	35438
pRSII405	Addgene	35440
pRSII406	Addgene	35442
pRSII424	Addgene	35466
pTPGI_dSpCas9_VP64	Addgene	49013
Q5 High-fidelity DNApolymerase	New England Biolabs	M0491
Restriction enzyme-Acc65I	New England Biolabs	R0599
Restriction enzyme-BamHI	New England Biolabs	R0136
Restriction enzyme-SacI-HF	New England Biolabs	R3156
Restriction enzyme-XhoI	New England Biolabs	R0146
Roche LightCycler 96	Roche	–	Real-Time PCR Instrument
S. cerevisiae CEN.PK2-1C	–	–	The parent strain. The genotype is: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2
Stem-Loop Kit	SparkJade	AG0502	Kit used in step 6.2.1.3
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	186-1096
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
T5 Exonuclease	New England Biolabs	M0363
Taq DNA ligase	New England Biolabs	M0208
Taq DNA polymerase	New England Biolabs	M0495
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye)	Takara	RR820Q
YeaStar RNA kit	Zymo Research	R1002
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E8875

References

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Yu, L., Zhang, Y., Marchisio, M. A. Gene Digital Circuits Based on CRISPR-Cas Systems and Anti-CRISPR Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64539, doi:10.3791/64539 (2022).