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Developmental Biology

विवो में ओवाइन भ्रूण में कैरोटिड रक्त प्रवाह पर दवा प्रभाव का वास्तविक समय अध्ययन

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/64551
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक गर्भाशय विकासशील भ्रूण में perivascularly दवाओं और जीन अभिव्यक्ति संशोधित एजेंटों देने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. महत्वपूर्ण रूप से, रक्त प्रवाह पर दवाओं / एजेंटों के प्रभाव को गर्भावस्था की प्रगति के साथ मापा जा सकता है।

Abstract

प्रणालीगत रक्तचाप (बीपी) में अचानक वृद्धि के जवाब में मस्तिष्क में निरंतर रक्त प्रवाह बनाए रखने के लिए एक जीव की क्षमता को सेरेब्रल ऑटोरेग्यूलेशन (सीएआर) के रूप में जाना जाता है, जो कैरोटिड धमनी में होता है। पूर्णकालिक नवजात शिशुओं के विपरीत, प्रीटरम नवजात शिशु बढ़े हुए प्रणालीगत बीपी के जवाब में मस्तिष्क रक्त प्रवाह (सीबीएफ) को कम करने में असमर्थ हैं। प्रीटरम नवजात शिशुओं में, यह नाजुक मस्तिष्क वाहिकाओं को उच्च छिड़काव दबाव में उजागर करता है, जिससे उनका टूटना और मस्तिष्क क्षति होती है। वायर मायोग्राफी का उपयोग करके पूर्व विवो अध्ययनों से पता चला है कि निकट अवधि के भ्रूण से कैरोटिड धमनियां एड्रीनर्जिक अल्फा 1 रिसेप्टर्स की सक्रियता के जवाब में संकुचित होती हैं। यह प्रतिक्रिया प्रीटरम भ्रूण में कुंद है। इस प्रकार, विवो में अल्फा 1-एआर की भूमिका की जांच करने के लिए, यहां प्रस्तुत गर्भधारण की विकासात्मक प्रगति के दौरान एक ओवाइन भ्रूण में विवो में कैरोटिड धमनी खंड पर दवाओं के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण है। प्रस्तुत डेटा भ्रूण के रक्त प्रवाह और रक्तचाप के एक साथ माप को प्रदर्शित करता है। पेरिवस्कुलर डिलीवरी सिस्टम का उपयोग कई दिनों तक दीर्घकालिक अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इस विधि के लिए अतिरिक्त अनुप्रयोगों में कैरोटिड धमनी के एक खंड में जीन की अभिव्यक्ति को बदलने के लिए वायरल डिलीवरी सिस्टम शामिल हो सकते हैं। इन विधियों को गर्भाशय में बढ़ते जीव के साथ-साथ वयस्क जीवों में अन्य रक्त वाहिकाओं पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

जन्म भ्रूण के लिए तनाव का कारण बनता है, और catecholamine के स्तर में काफी वृद्धि हुई है, प्रमुख तनावहार्मोन 1,2. यह प्रणालीगत बीपी उठाती है, और अगर इस दबाव मन्या धमनियों के माध्यम से नाजुक मस्तिष्क केशिकाओं को प्रेषित किया जाता है, यह उनके टूटना 3,4,5 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. प्रणालीगत बीपी में वृद्धि को पूर्णकालिक भ्रूण में कैरोटिड धमनियों के कसना द्वारा मस्तिष्क तक पहुंचने से रोका जाता है। हालांकि, इस तंत्र अपरिपक्व भ्रूण में विकसित नहीं है, और इस अपरिपक्व भ्रूण 4,5 में मस्तिष्क क्षति की काफी अधिक संभावना के लिए जिम्मेदार है.

वर्तमान में, विकासशील भ्रूण के साथ मन्या रक्त प्रवाह को विनियमित करने में शामिल रास्ते की परिपक्वता की जांच करने के लिए कोई उपयुक्त विधि मौजूद है. कैरोटिड रक्त प्रवाह और वासोरिस्पॉन्सिबिलिटी पर ये अध्ययन बुनियादी विज्ञान और नैदानिक दृष्टिकोण दोनों से महत्वपूर्ण हैं। वर्तमान में, धमनी सिकुड़न के नियमन में शामिल आणविक मार्गों को निर्धारित करने के लिए, मानक विधि में धमनी खंडों के पोस्टमॉर्टम को अलग करना शामिल है। फिर, प्रयोगों धमनी सिकुड़न 6,7 में शामिल नियामक रास्ते को परिभाषित करने कि विभिन्न औषधीय अणुओं की vasocontractility निर्धारित करने के लिए तार मायोग्राफी का उपयोग कर आयोजित कर रहे हैं. ध्यान दें, पूर्व विवो निष्कर्ष कैरोटिड धमनी के रक्त प्रवाह विनियमन अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के कारण विवो वातावरण में पूरी तरह से दोहराने में सक्षम नहीं हैं। इस प्रकार, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य एक ऐसी तकनीक विकसित करना है जो विवो में धमनी में रक्त प्रवाह पर वासोरेस्पॉन्सिव रसायनों या एजेंटों के प्रभावों को निर्धारित कर सके।

इस लेख में वर्णित पेरिवास्कुलर डिलीवरी पद्धति विभिन्न धमनी खंडों पर सिग्नलिंग मार्गों के औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विवो दृष्टिकोण प्रदान करती है। इस पद्धति का उपयोग करके, कोई भ्रूण के रक्तचाप और कैरोटिड रक्त प्रवाह में हेरफेर कर सकता है। इसके अतिरिक्त, एक विकासशील भ्रूण में सिग्नलिंग अणुओं के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए भेड़ भ्रूण के साथ प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाता है। उम्मीद है, प्रदान की गई विस्तृत पद्धति रक्त प्रवाह अध्ययन के क्षेत्र में नई जांच का नेतृत्व करेगी, विशेष रूप से भ्रूण शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के संबंध में।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन के लिए, पशु प्रयोगों के लिए अनुमोदन एरिजोना विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति से प्राप्त किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 2-4 वर्ष की आयु के बीच एक समय-संभोगी, गर्भवती कोलंबिया-रामबोइलेट ईव्स का उपयोग किया गया था। जानवरों को एरिजोना भेड़ इकाई विश्वविद्यालय से प्राप्त किया गया था।

1. पशु रखरखाव

  1. किसी भी भेड़ के खेत से जानवरों को प्राप्त करें।
  2. ईव्स को 105 दिनों ± 5 दिनों से 137 दिनों ± 5 दिनों की गर्भकालीन आयु (डीजीए) में प्रयोगशाला में ले जाएं। भेड़ को परिवेश आर्द्रता में 22 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें। अल्फाल्फा छर्रों ( सामग्री की तालिकादेखें), लवण और पानी विज्ञापन लिबिटम प्रदान करें।

2. सामग्री तैयार करना

  1. पेरिवास्कुलर कैथेटर सिस्टम का निर्माण करें।
    1. एक 2 सेमी कई गुना पंप टयूबिंग (एमपीटी) के लिए Tygon टयूबिंग के 4 फीट के एक छोर में शामिल हों ( सामग्री की तालिकादेखें). 2 सेमी एमपीटी के दूसरे छोर को टाइगॉन ट्यूब के दूसरे 4 फीट से संलग्न करें।
    2. एमपीटी में एक छोटा सा भट्ठा बनाएं ताकि तरल / एजेंट पेरिवस्कुलर स्पेस में बाहर आ सकें।
  2. प्रवाह जांच ( सामग्री की तालिकादेखें), कैथेटर, और गैस नसबंदी विधि का उपयोग कर एक छोटे पेचकश जीवाणुरहित जीवाणुरहित करें।

3. शल्य चिकित्सा पशु तैयारी

  1. संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से पशु प्रयोगों के लिए अनुमोदन प्राप्त करें।
  2. सर्जरी से पहले, 24 घंटे के लिए शून्य प्रति ओएस (एनपीओ) भोजन और 16 घंटे के लिए एनपीओ पानी पर ईव्स रखें। सर्जरी के दिन, उसकी आंखों की सुरक्षा के लिए ईव के चेहरे को पैड से लपेटें। गले की नस को उजागर करने के लिए गर्दन के बाईं ओर दाढ़ी, और पोविडोन-आयोडीन और 70% इथेनॉल का उपयोग करके त्वचा को साफ करें।
    1. ईव के गले की नस में एक अंतःशिरा (चतुर्थ) कैथेटर रखें, और इसे निविड़ अंधकार टेप और घाव क्लिप के साथ त्वचा पर सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. डायजेपाम (0.15 मिलीग्राम/किग्रा) और केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (16 मिलीग्राम/किग्रा) के IV प्रशासन के साथ ईव्स को एनेस्थेटाइज करें। पेनिसिलिन जी प्रोसेन सस्पेंशन (25,000 I/kg) और IV केटोप्रोफेन (2.2 mg/kg) का IM इंजेक्शन दें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  4. भेड़ और आसपास के क्षेत्रों (पेट, पार्श्व, और कमर) के चीरा स्थल को #10 ब्लेड क्लिपर्स के साथ शेव करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊन पूरी तरह से हटा दिया गया है, # 40 ब्लेड के साथ क्षेत्र को फिर से शेव करें। मुंडा क्षेत्र को कीटाणुनाशक क्लींजर ( सामग्री की तालिकादेखें) और पानी से धोएं। डिस्पोजेबल पैड से सुखाएं।
  5. संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें (त्वचा चुटकी, कॉर्नियल रिफ्लेक्स और जबड़े टोन के आकलन के जवाब द्वारा निर्धारित और बनाए रखा जाता है), और फिर 6.5-7.5 मिमी आंतरिक व्यास एंडोट्रैचियल ट्यूब ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ईवे को इंटुबेट करें, और ट्यूब को सुरक्षित करें। पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में एक लिफ्ट टेबल पर ईव रखें, और लापरवाह स्थिति में एक वी-टॉप सर्जिकल टेबल में स्थानांतरित करें।
    1. सर्जिकल टाई-डाउन के साथ ईव के अंगों को वी-टॉप सर्जिकल टेबल पर सुरक्षित करें। भ्रूण-अपरा इकाई पर दबाव कम करने के लिए ईवे को ट्रेंडेलनबर्ग स्थिति में लाएं।
  6. ऑक्सीहीमोग्लोबिन संतृप्ति और हृदय गति की लगातार निगरानी के लिए ईवे की जीभ/कान में एक पल्स ऑक्सीमीटर जांच ( सामग्री की तालिकादेखें) संलग्न करें। तापमान की निगरानी के लिए ईव की जीभ के नीचे एक थर्मामीटर रखें।
    1. एंडोट्रैचियल ट्यूब को एनेस्थीसिया मशीन के श्वसन सर्किट से कनेक्ट करें, और समाप्त सीओ2 की निगरानी करते हुए यांत्रिक वेंटिलेशन शुरू करें।
  7. सर्जरी के दौरान 2.5% -4% के बीच आइसोफ्लुरेन को समायोजित करके संज्ञाहरण बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि कान को पिंच करके जानवर को पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी किया गया है। चरण 3.2.1 के दौरान रखे गए जुगुलर कैथेटर का उपयोग करके 5 एमएल/किग्रा/एच पर एक संतुलित पॉली-आयनिक (खारा 0.9% डब्ल्यू/वी) समाधान का प्रशासन करें।
  8. एक बाँझ स्क्रब करें। पेट क्षेत्र और फ्लैंक्स को पोविडोन समाधान (10% आयोडीन समाधान) के साथ स्प्रे करें। चीरा साइट से शुरू होने वाले आयोडीन से लथपथ धुंध के साथ क्षेत्र को साफ़ करें और बाहर की ओर काम करें, सुनिश्चित करें कि बाहर की ओर स्क्रबिंग के बाद केंद्र में वापस न जाएं।
    1. इसके बाद, इथेनॉल (70% इथेनॉल डब्ल्यू / वी) के साथ क्षेत्र को स्प्रे करें, और पोविडोन के साथ स्क्रबिंग के समान तरीके से इथेनॉल से लथपथ धुंध के साथ साफ़ करें। पूरी प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। पोविडोन घोल के साथ क्षेत्र को स्प्रे करें।
  9. एक बाँझ कंटेनर में गर्म खारा, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक लाएं। इसे सर्जिकल टेबल के पास रखें। दाग़ को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. सर्जिकल टीम के सदस्यों को कैप, फेस मास्क और शू कवर पहनाएं, अपने हाथ धोएं (सर्जिकल स्क्रब), और निष्फल सर्जिकल गाउन और दस्ताने पहनें। इस बिंदु से, एक सख्त बाँझ शल्य चिकित्सा अभ्यास का पालन किया जाना चाहिए।
  11. निष्फल भेड़ के पेट क्षेत्र को बाँझ तौलिये से लपेटें।

4. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. भ्रूण को बाहरी बनाना
    1. संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करने के बाद, नाभि से उदर के कपाल भाग तक लाइनिया अल्बा पर एक स्केलपेल (# 20 ब्लेड) का उपयोग करके 10 सेमी मानक लैपरोटॉमी चीरा करें। एक दाग़ना (पावर सेटिंग्स: 50 कट और 25 जमावट) के साथ चीरा बनाते समय रक्तस्राव को नियंत्रित करें।
      1. त्वचा चीरा के नीचे शरीर की दीवार के मध्य रेखा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाओ, और Metzenbaum कैंची ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग पेट गुहा खुला.
    2. पेट की दीवार के माध्यम से भ्रूण युक्त गर्भाशय को बाहरी रूप दें, जबकि नीचे (मातृ पेट और गर्भाशय के बीच) बाँझ सर्जिकल तौलिए रखें। भ्रूण की स्थिति और बीजपत्र निर्धारित करने के लिए गर्भाशय को पल्पेट करें। एक दाग़ना का प्रयोग, सिर के पृष्ठीय पर एक बड़ी वक्रता के साथ गर्भाशय की दीवार के माध्यम से एक ~ 10 सेमी चीरा बनाने, किसी भी दृश्य रक्त वाहिकाओं और प्लेसेंटोम से परहेज.
    3. गर्भाशय और अपरा झिल्ली को सुरक्षित करने के लिए चार बैबॉक क्लैंप ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें, और भ्रूण के सिर को दृश्यमान बनाने के लिए चार विरोधी कोनों पर बैबॉक क्लैंप खींचें। इस चीरा के माध्यम से भ्रूण के कपाल आधे को बाहरी करें, और सांस लेने की दीक्षा को रोकने के लिए गर्म, बाँझ खारा (37 डिग्री सेल्सियस) से भरे एक बाँझ, गैर-लेटेक्स दस्ताने के साथ भ्रूण के सिर को कवर करें।
  2. मन्या धमनी perivascular कैथेटर के इंस्ट्रूमेंटेशन
    1. गर्भाशय से भ्रूण के सिर को हटाते समय, एक सहायक को धीरे से एमनियोटिक द्रव के नुकसान को कम करने के लिए बैबॉक संदंश को सीधा रखें। भ्रूण की गर्दन को उजागर करने के साथ, मध्य क्षेत्र में गर्दन के एक तरफ स्टर्नोक्लेडोमैस्टॉइड (एससीएम) मांसपेशी के पूर्वकाल सीमा के साथ 3-3.5 सेमी तिरछी त्वचा चीरा करें, और मच्छर संदंश के साथ प्रावरणी को अलग करें।
      1. प्लैटिस्मा को विभाजित करें, और एससीएम मांसपेशी की औसत दर्जे की सीमा के साथ अपने कण्डरा से ओमोहियोइड मांसपेशी के स्तर तक अवर रूप से एक विच्छेदन करें। एससीएम को वापस लेने से कैरोटिड शीट का पर्दाफाश होगा, जिसमें सतही रूप से एक पतली दीवार वाली आंतरिक जुगुलर नस होती है, और इसके नीचे कैरोटिड धमनी एक मोटी दीवार वाले पोत के रूप में होगी।
      2. Babcock clamps के साथ त्वचा को वापस लेना, और आसपास के ऊतक और मन्या चादर से मन्या धमनी मुक्त करने के लिए एक कुंद विच्छेदन प्रदर्शन.
    2. बाँझ पैक से 3 मिमी प्रवाह जांच ( सामग्री की तालिकादेखें) लें, जांच की बैकिंग प्लेट को हटा दें, और एल-ब्रैकेट को उजागर करने के लिए इसे खुला स्लाइड करें। ध्यान से मन्या धमनी लिफ्ट, और धीरे पोत के साथ संपर्क से बचने जबकि पोत के नीचे ब्रैकेट हुक.
      1. धीरे एक बंद स्थिति के लिए समर्थन प्लेट फिसलने से प्रवाह जांच ब्रैकेट बंद करने के लिए संदंश का प्रयोग करें. प्रवाह जांच के बैकिंग स्क्रू को कसकर फ्लो प्रोब ब्रैकेट को सुरक्षित करें। इस प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए, धीरे प्रवाह जांच के सिरों को संदंश के साथ पकड़ें ताकि प्रवाह जांच को स्थिर किया जा सके, जबकि पेंच कड़ा किया जा रहा है।
    3. पेरिवास्कुलर कैथेटर को प्री-फ्लश करें, और इसे फ्लो जांच के समीपस्थ कैरोटिड धमनी के करीब आसपास के क्षेत्र में रखें। सुनिश्चित करें कि पेरिवस्कुलर कैथेटर का खुला भट्ठा कैरोटिड धमनी के करीब है।
      1. एक 3-0 रेशम nonabsorbable सीवन के साथ, perivascular प्रणाली के समीपस्थ और बाहर का सिरों और पास के अंतरालीय ऊतक के लिए प्रवाह जांच सुरक्षित है. एक सतत सिलाई का उपयोग चीरा साइट बंद करें, एक 3-0 रेशम nonabsorbable सीवन के साथ भ्रूण त्वचा बंद करें, और कैथेटर तीन बार चारों ओर सिवनी लपेटकर त्वचा के लिए कैथेटर सुरक्षित. दस्ताने निकालें, और भ्रूण के सिर को गर्भाशय में वापस रखें।
  3. भ्रूण अंग कैथीटेराइजेशन
    1. भ्रूण के हिंद पैर को बाहरी करें। पैर पकड़ो, और आंतरिक जांघ क्षेत्र की कल्पना करने के लिए इसे बग़ल में घुमाएं। बाँझ धुंध के साथ क्षेत्र को साफ करें, 2 सेमी चीरा करें, और ऊरु धमनी को उजागर करें। जगह और मन्या के साथ किया के रूप में एक समान प्रक्रिया के बाद प्रवाह जांच सुरक्षित, और फिर चीरा बंद.
    2. घुटने के लिए टिबिया ~ 0.5 सेमी बाहर का पहलू के साथ एक 2 सेमी चीरा बनाओ. पीछे टिबियल धमनी (मोटी दीवार वाली) और सफ़ीन नस (पतली दीवार वाली) का पर्दाफाश करें। एक मानक कट-डाउन तकनीक का उपयोग करके पीछे की टिबियल धमनी और सफ़ीन नस में पॉलीविनाइल कैथेटर (बाहरी व्यास: 1.4 मिमी और आंतरिक व्यास: 0.9 मिमी) डालें, जैसा कि नीचे बताया गया है:
      1. कुंद विच्छेदन के साथ ब्याज के पोत मुक्त. तीन फेंकता के साथ एक वर्ग गाँठ का उपयोग कर एक 3-0 रेशम सिवनी (कोई सुई) के साथ पोत के बाहर का हिस्सा लिगेट. पोत के समीपस्थ पहलू (पोत के नीचे) पर एक दूसरा रेशम मुक्त टाई रखें, लेकिन संयुक्ताक्षर को खुला छोड़ दें। कास्त्रोविएजो कैंची ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके, डिस्टल संयुक्ताक्षर के लिए पोत 2 मिमी समीपस्थ में एक छोटा, अनुप्रस्थ कट बनाएं। कट की लंबाई पोत के व्यास का ~ 25% होनी चाहिए।
      2. धीरे समीपस्थ, खुला सीवन पर ऊपर खींचकर पोत रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित. बाँझ heparinized खारा के साथ कैथेटर भरें. कैथेटर के beveled अंत डालें, और भ्रूण पोत में टिप 20 सेमी अग्रिम.
      3. संदंश के साथ जगह में कैथेटर पकड़ो, जबकि एक सहायक समीपस्थ रेशम मुक्त टाई सीवन बांधता कैथेटर के लिए पोत सुरक्षित; तीन फेंकता के साथ सम्मिलन स्थल से वर्ग समुद्री मील 2 मिमी का उपयोग कर डाला कैथेटर के आसपास पोत पूरी तरह से ligrate. डिस्टल संयुक्ताक्षर समीपस्थ टाई समीपस्थ टाई पोत कैथेटर को सुरक्षित करने के लिए टाई.
    3. एक सतत सिवनी पैटर्न का उपयोग कर एक 3-0 रेशम nonabsorbable सिवनी का उपयोग कर त्वचा चीरा बंद करें. सुनिश्चित करें कि खींचे जाने पर रक्त प्रवाह को प्रतिबंधित करने से बचने के लिए कैथेटर के चारों ओर टांके बंधे हैं। गर्भाशय में एक पूर्व फ्लश कैथेटर रखें, और एक 3-0 nonabsorbable रेशम सीवन का उपयोग कर एक सिवनी द्वारा भ्रूण के लिए सुरक्षित.

5. भ्रूण को वापस रखना और घाव को बंद करना

  1. भ्रूण को गर्भाशय में लौटाएं। एक सतत लॉकिंग (कुशिंग) पैटर्न के साथ 3-0 nonabsorbable रेशम टांके का उपयोग कर भ्रूण झिल्ली सीवन. एक 3-0 nonabsorbable रेशम सीवन का उपयोग कर गर्भाशय पेशी परत बंद करें.
  2. स्टेनलेस स्टील सर्जिकल रॉड में एक 18 डालें चमड़े के नीचे पेट की दीवार के साथ पैराकोस्टल क्षेत्र तक. रॉड के समीपस्थ अंत एक 1 सेमी चीरा प्रदर्शन द्वारा पैराकोस्टल साइट से बाहर निकलने दें.
    1. सर्जिकल रॉड के बाहर के छोर पर कैथेटर संलग्न करें, और एक सहायक पैराकोस्टल उद्घाटन के माध्यम से रॉड को पूरी तरह से धक्का देकर पैराकोस्टल निकास स्थल के माध्यम से कैथेटर और प्रवाह जांच केबल को खिलाएं।
  3. पैराकोस्टल चीरा स्थल पर सभी कैथेटर और प्रवाह जांच केबलों को सुरक्षित करें। निविड़ अंधकार टेप के साथ रखें, और ईव की त्वचा के लिए कैथेटर सीवन. कैथेटर पर ईवे के बाहरी हिस्से में एक प्लास्टिक की जाली थैली को सीवन करें और कैथेटर को स्टोर करने के लिए जांच करें।
    1. 1-0 मोनोफिलामेंट सिंथेटिक शोषक सिवनी सामग्री का उपयोग करके, एक निरंतर पैटर्न के साथ लाइनिया अल्बा को सुरक्षित करें। सर्जिकल स्टेपल के साथ त्वचा की परत को सुरक्षित करें।
  4. सामान्य संज्ञाहरण बंद करो, और ईवे extubate एक बार स्वरयंत्र सजगता सामान्य आधार रेखा पर लौट आए हैं. जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह पूरी तरह से होश में न आ जाए। सामान्य संज्ञाहरण के बाद स्थिर होने के बाद ईव को चयापचय गाड़ी में ले जाएं। संज्ञाहरण से पूरी तरह से उबरने के बाद पोस्ट ऑपरेटिव प्रयोग कक्ष में पशु लौटें.
  5. 3 दिनों के लिए अंतःशिरा (10 मिलीग्राम / किग्रा / दिन फेनिलबुटाज़ोन) के बाद के दर्दनाशक दवाओं का प्रशासन करें। संवहनी कैथेटर को हेपरिनाइज्ड खारा समाधान (0.9% NaCl समाधान में 100 U/mL हेपरिन) के साथ दैनिक फ्लश करें।

6. विवो प्रयोगों में पोस्ट-ऑपरेटिव

  1. कैथेटर को हर दिन हेपरिनाइज्ड खारा (75 यू / एमएल) के साथ फ्लश करें। किसी भी माप करने से पहले 72 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें. रक्त प्रवाह को मापने के लिए, पेरिवास्कुलर फ्लो मॉड्यूल के साथ भ्रूण में डाले गए प्रवाह जांच को पावरलैब और एक संलग्न कंप्यूटर में संलग्न करें।
    नोट: रिकॉर्डिंग मन्या और ऊरु रक्त प्रवाह को मापने के लिए PowerLab सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) पर किया जा सकता है. 30 मिनट के लिए आधारभूत माप ले लो.
  2. एक एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर से जुड़े पुल एम्पलीफायर के लिए धमनी और एमनियोटिक कैथेटर संलग्न करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। अंतःशिरा भ्रूण को 10 यूएम फेनिलफ्राइन के 1 एमएल बोलस का प्रशासन करें, और 15 मिनट के लिए कैरोटिड और ऊरु प्रवाह को मापें। फिर, 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक रक्त प्रवाह आधार रेखा पर लौटता है.
  3. पेरिवास्कुलर कैथेटर में 10 यूएम फेनिलफ्राइन के 1 एमएल को संक्रमित करें, और 15 मिनट के लिए रक्त प्रवाह को मापें। पेरिवास्कुलर कैथेटर के माध्यम से गर्म खारा के 5 एमएल प्रशासन द्वारा फिनाइलफ्राइन को धो लें। फिर, 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक रक्त प्रवाह आधार रेखा पर लौटता है.

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Representative Results

रक्त प्रवाह के विवो हेरफेर में स्थानीयकृत की जांच करने के लिए, फिनाइलफ्राइन (10 माइक्रोन) के 1 एमएल, एक α1-एआर एगोनिस्ट, स्थानीय मन्या रक्त प्रवाह पर प्रभाव और प्रणालीगत रक्तचाप पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए एक बाहरी जलसेक कैथेटर द्वारा मन्या धमनी के पेरिवस्कुलर अंतरिक्ष में प्रशासित किया गया था। चित्रा 1 ए निकट अवधि भ्रूण भेड़ में प्रणालीगत रक्तचाप पर किसी भी प्रभाव के बिना मन्या रक्त प्रवाह में एक महत्वपूर्ण कमी को दर्शाता है. चित्रा 1 बी एक अपरिपक्व भ्रूण के लिए एक ही डेटा से पता चलता है. चतुर्थ मार्ग द्वारा पीएचई के 1 एमएल प्रशासन निकट अवधि भ्रूण भेड़ (चित्रा 1 सी) में मन्या रक्त प्रवाह को प्रभावित किए बिना प्रणालीगत रक्त प्रवाह में वृद्धि हुई. चित्रा 1 डी एक अपरिपक्व भ्रूण के लिए एक ही डेटा से पता चलता है. इसके विपरीत, एक पेरिवास्कुलर कैथेटर द्वारा पीएचई के प्रशासन का प्रीटरम भेड़ में कोई प्रभाव नहीं पड़ा; हालांकि, अंतःशिरा मार्ग द्वारा प्रशासन ने कैरोटिड रक्त प्रवाह और प्रणालीगत बीपी दोनों में उल्लेखनीय वृद्धि की। यह प्रयोग एक पूरी तरह कार्यात्मक पेरिवास्कुलर आस्तीन को प्रदर्शित करता है जो प्रणालीगत बीपी को प्रभावित किए बिना गर्भाशय में कैरोटिड धमनी में रक्त प्रवाह को नियंत्रित कर सकता है। परिणाम बताते हैं कि प्रीटरम भ्रूण फेनिलफ्रिन-मध्यस्थता कैरोटिड रक्त प्रवाह विनियमन के लिए उत्तरदायी नहीं हैं; हालांकि, प्रतिक्रिया निकट अवधि के भ्रूणों (चित्रा 1ई) में परिपक्व है। महत्वपूर्ण बात, पीएचई के चतुर्थ प्रशासन मन्या रक्त प्रवाह केवल अपरिपक्व भ्रूण में वृद्धि हुई, निकट अवधि के भ्रूण (चित्रा 1 जी) में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ. हालांकि, पीएचई के चतुर्थ प्रशासन ने प्रीटरम और निकट-अवधि भ्रूण(चित्रा 1एच)दोनों में प्रणालीगत रक्तचाप बढ़ाया। परिणाम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि फिनाइलफ्राइन के पेरिवास्कुलर टपकाने का प्रणालीगत रक्तचाप(चित्रा 1एफ)पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

Figure 1
चित्रा 1: रक्त प्रवाह के विवो हेरफेर में । प्रणालीगत रक्तचाप और मन्या धमनी रक्त प्रवाह आधारभूत माप और परिवर्तन के प्रशासन के बाद परिवर्तन का एक अनुकरणीय निशान (पीएचई) से perivascular कैथेटर के माध्यम से (ए) गर्भाशय निकट अवधि भ्रूण में और (बी) गर्भाशय preterm भ्रूण में एक. प्रणालीगत रक्तचाप और मन्या धमनी रक्त प्रवाह आधारभूत माप और फिनाइलफ्राइन (पीएचई) के अंतःशिरा प्रशासन के बाद परिवर्तन का एक अनुकरणीय निशान (सी) गर्भाशय में एक निकट अवधि के भ्रूण और (डी) गर्भाशय में एक अपरिपक्व भ्रूण। मन्या रक्त प्रवाह के (ई) प्रतिशत और (एफ) निकट अवधि और अपरिपक्व भेड़ के लिए perivascular कैथेटर वितरण प्रणाली के माध्यम से प्रणालीगत रक्तचाप में परिवर्तन दिखाया गया है. मन्या रक्त प्रवाह के (जी) प्रतिशत में परिवर्तन और (एच) प्रणालीगत रक्तचाप निकट अवधि और अपरिपक्व भेड़ के लिए प्रणालीगत प्रशासन के माध्यम से दिखाया गया है. त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि प्रदर्शित करती हैं। प्रत्येक समूह में N = 4। * पी < 0.05 एक छात्र के टी-टेस्ट द्वारा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान में, दवा यौगिकों और जीन हेरफेर के जवाब में विवो में पोत सिकुड़न और फैलाव की जांच करने के लिए कोई विधि मौजूद नहीं है। क्षेत्र में एक मानक के रूप में, विवो में रक्त प्रवाह को डॉपलर प्रवाह जांच, माइक्रोसेफर्स और रेडियोधर्मी अणुओं जैसे ट्राइटेटेड पानी द्वारा मापा जाता है। हालांकि, रिसेप्टर्स के कार्यों या डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग में हेरफेर करने के लिए, जानवरों की बलि दी जाती है, और धमनी खंडों के अलगाव के बाद अंग स्नान में इन विट्रो में प्रयोग किए जाते हैं। वर्तमान विधियां जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए रसायनों या वैक्टर को पेश करके धमनी खंडों के विवो जोड़तोड़ में आचरण करने का एक तरीका प्रदान करती हैं। इसके अलावा, एजेंटों की स्थानीय डिलीवरी के कारण इस पद्धति का प्रणालीगत परिसंचरण पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है।

वर्तमान प्रयोगों से पता चलता है कि फिनाइलफ्राइन के प्रशासन के परिणामस्वरूप रक्त प्रवाह में कमी के साथ कैरोटिड धमनी का कसना होता है। उपरोक्त जांच मस्तिष्क में मन्या धमनी रक्त प्रवाह को विनियमित करने में अल्फा-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स की भूमिका को स्पष्ट करती है। इस तकनीक का उपयोग जीवित भ्रूणों में वास्तविक समय में रक्त प्रवाह पर विभिन्न औषधीय यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है। पेरिवास्कुलर कैथेटर का उपयोग पेरिवास्कुलर स्पेस में लेंटवायरस को स्थापित करने के लिए भी किया जा सकता है, जिसे वास्कुलचर द्वारा लिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप वांछित सिग्नलिंग प्रोटीन या रिसेप्टर का नॉकडाउन या ओवरएक्सप्रेशन होता है।

दशकों के लिए, अंग और ऊतक स्नान पोत सिकुड़न 6,8,9 के बारे में उपयोगी डेटा प्रदान की है. हालांकि, ये अध्ययन पूर्व विवो हैं, जो विवो में प्रजनन क्षमता के बारे में सवाल उठाता है और इसका मतलब है कि निरंतर माप नहीं किया जा सकता है। इस सीमा को दूर करने के लिए, यह अभिनव दृष्टिकोण विवो में कैरोटिड धमनी रक्त प्रवाह की जांच करता है। इस पद्धति में एक अतिरिक्त प्रगति में वायरस वितरण दृष्टिकोण का उपयोग करके आनुवंशिक मॉड्यूलेशन को अपनाना शामिल होगा, जो धमनी खंडों को आनुवंशिक रूप से shRNA या CRISPR / Cas9 वितरित करके जीन अभिव्यक्ति को अपग्रेड और डाउनरेगुलेट करने की अनुमति देगा।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम निकटता में पोत के समानांतर perivascular कैथेटर रख रहा है. इसके लिए काम करने के लिए, किसी को लक्षित धमनी के व्यास को जानना होगा। इसके अतिरिक्त, एक उचित आस्तीन विकसित करना महत्वपूर्ण है। कोई आस्तीन को धमनी के आस-पास रखने के बजाय संशोधित करने के लिए रख सकता है। यह रसायनों और लक्ष्यीकरण एजेंटों की स्थानीय डिलीवरी भी प्रदान करेगा।

विधि की सीमा यह है कि यह केवल धमनी के एक खंड को नियंत्रित करता है, और अंग या ऊतक रक्त प्रवाह के बारे में परिणामों की सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए। वांछित प्रभाव प्राप्त करने के लिए आस्तीन की लंबाई और रसायनों की मात्रा को बदलने की आवश्यकता हो सकती है। विधि जीवित भ्रूण में जीन विनियमन modulating में व्यापक अनुप्रयोगों है. यह किसी भी ऊतक के एक हिस्से में जीन फ़ंक्शन और अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, विधि को एक वयस्क जीव में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है।

हालांकि वहाँ इस तरह के transonic प्रवाह जांच10, लेजर डॉपलर11, और microspheres12 का उपयोग कर के रूप में विवो रक्त प्रवाह में मापने के लिए अन्य तरीकों रहे हैं, उन तरीकों में से कोई भी धमनी खंड में रक्त प्रवाह पर दवाओं के स्थानीय प्रभाव की जांच के लिए अनुमति के रूप में हस्तक्षेप के प्रणालीगत प्रभाव के विरोध में. इस प्रकार, वर्तमान विधि अद्वितीय है, क्योंकि यह बिना किसी प्रणालीगत प्रभाव के स्थानीय रक्त प्रवाह को माप और संशोधित कर सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

इन अध्ययनों के लिए एरिज़ोना विश्वविद्यालय से इंट्राम्यूरल फंड का उपयोग किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aaron Bovie Electrosurgical Cautery Henry Schein, Inc 5905974 
Aaron Bovie Electrosurgical Generator Henry Schein, Inc 1229913
Alfalfa Pellets Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ 100-80 
Analog to Digital Converter ADI Instruments Powerlab
Babcock forceps Roboz Surgicals RS8020
Bridge Amplifier ADI Instruments Bridge Amplifier
Castroviejo scissors Roboz Surgicals RS5650SC
Diazepam Henry Schein, Inc 1278188
Endotracheal Tube Henry Schein, Inc 7020408 
Flow Probes Transonic Systems Inc. MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC
Heparin Henry Schein, Inc 1162406 
Isoflurane Henry Schein, Inc 1182097
Ketamine Henry Schein, Inc 1273383
Ketoprofen Zoetis Inc., Kalamazoo, MI Ketofen
Manifold Pump Tubing Fisher Scientific 14-190-508
Metzenbaum scissors Roboz Surgicals RS6010
Narkomed 4 Anesthesia Machine North American Dräger  Narkomed 4
Normal Saline Fisher Scientific Z1376
penicillin G procaine suspension  Henry Schein, Inc 7455874
phenylbutazone VetOne Boise, ID 510226
Phenylephrine Sigma Aldrich Inc. P1240000
Pivodine Scrub VetOne  510094 Germicidal cleanser
PowerLab ADInstruments Data acquisition hardware device
Pulse Oximeter Amazon Inc. UT100V 
Tygon Tubing Fisher Scientific ND-100-80
V-Top Surgical Table VetLine Veterinary Classic Surgery TSP-4010
Wound Clips Fisher Scientific 10-001-024

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 194 ड्रग इफेक्ट्स कैरोटिड ब्लड फ्लो ओवाइन भ्रूण सेरेब्रल ऑटोरेग्यूलेशन सीएआर कैरोटिड धमनी प्रीटरम नियोनेट्स सेरेब्रल ब्लड फ्लो सीबीएफ एड्रीनर्जिक अल्फा 1 रिसेप्टर्स अल्फा 1-एआर इनोवेटिव एप्रोच ड्रग्स इफेक्ट्स कैरोटिड धमनी सेगमेंट ओवाइन भ्रूण गर्भधारण भ्रूण रक्त प्रवाह रक्तचाप माप पेरिवास्कुलर डिलीवरी सिस्टम दीर्घकालिक अध्ययन वायरल डिलीवरी सिस्टम जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन
<em>विवो में</em> ओवाइन भ्रूण में कैरोटिड रक्त प्रवाह पर दवा प्रभाव का वास्तविक समय अध्ययन
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Pendleton, A. L., Limesand, S. W.,… More

Pendleton, A. L., Limesand, S. W., Goyal, R. In Vivo Real-Time Study of Drug Effects on Carotid Blood Flow in the Ovine Fetus. J. Vis. Exp. (194), e64551, doi:10.3791/64551 (2023).

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