Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om geneesmiddelen en genexpressiemodificerende middelen perivasculair toe te dienen in een in utero ontwikkelende foetus. Belangrijk is dat het effect van medicijnen/middelen op de bloedstroom kan worden gemeten met de progressie van de zwangerschap.
Abstract
Het vermogen van een organisme om een constante bloedtoevoer naar de hersenen te handhaven als reactie op plotselinge pieken in de systemische bloeddruk (BP) staat bekend als cerebrale autoregulatie (CAR), die optreedt in de halsslagader. In tegenstelling tot voldragen pasgeborenen zijn te vroeg geboren pasgeborenen niet in staat om de cerebrale bloedstroom (CBF) te verminderen als reactie op een verhoogde systemische bloeddruk. Bij te vroeg geboren pasgeborenen stelt dit de fragiele hersenvaten bloot aan hoge perfusiedruk, wat leidt tot hun breuk en hersenbeschadiging. Ex vivo-studies met behulp van draadmyografie hebben aangetoond dat halsslagaders van foetussen op korte termijn vernauwen als reactie op de activering van adrenerge alfa1-receptoren. Deze reactie is afgestompt bij de te vroeg geboren foetus. Dus, om de rol van alfa1-AR in vivo te onderzoeken, wordt hier een innovatieve benadering gepresenteerd om de effecten van geneesmiddelen op een halsslagadersegment in vivo bij een schapenfoetus te bepalen tijdens de ontwikkelingsprogressie van de zwangerschap. De gepresenteerde gegevens demonstreren de gelijktijdige meting van de foetale bloedstroom en bloeddruk. Het perivasculaire toedieningssysteem kan worden gebruikt om een langetermijnonderzoek over meerdere dagen uit te voeren. Aanvullende toepassingen voor deze methode zijn onder meer virale afgiftesystemen om de expressie van genen in een segment van de halsslagader te veranderen. Deze methoden kunnen zowel in utero als in volwassen organismen worden toegepast op andere bloedvaten in het groeiende organisme.
Introduction
De geboorte veroorzaakt stress bij de foetus en er is een aanzienlijke toename van de niveaus van catecholamine, het belangrijkste stresshormoon 1,2. Dit verhoogt de systemische bloeddruk en als deze druk via de halsslagaders wordt doorgegeven aan de fragiele haarvaten van de hersenen, kan dit leiden tot hun breuk 3,4,5. Pieken in systemische bloeddruk worden verhinderd om de hersenen te bereiken door de vernauwing van de halsslagaders bij de voldragen foetus. Dit mechanisme is echter niet ontwikkeld bij de te vroeg geboren foetus, en dit is verantwoordelijk voor de significant hogere kans op hersenbeschadiging bij te vroeg geboren foetussen 4,5.
Momenteel bestaat er geen geschikte methode om de rijping te onderzoeken van de routes die betrokken zijn bij het reguleren van de bloedstroom van de halsslagader bij zich ontwikkelende foetussen. Deze studies naar de doorbloeding van de halsslagader en de vasoresponsiviteit zijn cruciaal vanuit zowel fundamenteel wetenschappelijk als klinisch perspectief. Om de moleculaire routes te bepalen die betrokken zijn bij de regulatie van arteriële contractiliteit, omvat de standaardmethode momenteel het postmortem isoleren van de arteriële segmenten. Vervolgens worden de experimenten uitgevoerd met behulp van draadmyografie om de vasocontractiliteit te bepalen van verschillende farmacologische moleculen die de regulerende routes definiëren die betrokken zijn bij arteriële contractiliteit 6,7. Merk op dat de ex vivo bevindingen niet in staat zijn om de in vivo omgeving volledig te repliceren vanwege de regulering van de bloedstroom stroomopwaarts en stroomafwaarts van de halsslagader. De huidige studie was dus gericht op het ontwikkelen van een techniek die de effecten van vaatresponsieve chemicaliën of middelen op de bloedstroom in een slagader in vivo kan bepalen.
De perivasculaire toedieningsmethodologie die in dit artikel wordt beschreven, biedt een in vivo benadering om het effect van de farmacologische of genetische manipulatie van signaalroutes op verschillende arteriële segmenten te bestuderen. Met behulp van deze methode kan men de foetale bloeddruk en de bloedstroom van de halsslagader manipuleren. Daarnaast worden experimenten met schapenfoetussen gedemonstreerd voor het bestuderen van de effecten van signaalmoleculen in een zich ontwikkelende foetus. Hopelijk zal de gedetailleerde methodologie leiden tot nieuw onderzoek op het gebied van bloedstroomstudies, vooral met betrekking tot foetale fysiologie en pathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor de huidige studie werd goedkeuring voor de dierproeven verkregen van de Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Arizona. Voor de huidige studie werden eenmalig gedeven, drachtige Columbia-Rambouillet-ooien tussen de 2-4 jaar oud gebruikt. De dieren zijn afkomstig van de University of Arizona Sheep Unit.
1. Onderhoud van dieren
- Verkrijg dieren van een schapenboerderij.
- Vervoer de ooien naar het laboratorium na 105 dagen ± 5 dagen tot 137 dagen ± 5 dagen zwangerschapsduur (dGA). Houd de schapen op een temperatuur van 22 °C ± 1 °C in omgevingsvochtigheid. Zorg ad libitum voor luzernekorrels (zie materiaaltabel), zouten en water.
2. Voorbereiding van het materiaal
- Construeer het perivasculaire kathetersysteem.
- Verbind het ene uiteinde van 4 ft Tygon-slang met een 2 cm spruitstukpompslang (MPT) (zie Materiaaltabel). Bevestig het andere uiteinde van de MPT van 2 cm aan een andere 4 ft Tygon-buis.
- Maak een kleine spleet in de MPT zodat de vloeistof/middelen in de perivasculaire ruimte kunnen komen.
- Steriliseer de flowsondes (zie Materiaaltabel), katheters en een kleine schroevendraaier met behulp van de gassterilisatiemethode.
3. Preoperatieve voorbereiding van dieren
- Verkrijg goedkeuring voor dierproeven van de Institutional Animal Care and Use Committee.
- Houd de ooien voorafgaand aan de operatie 24 uur op nul per os (NPO) voer en 16 uur op NPO-water. Wikkel op de dag van de operatie het gezicht van de ooi in met een kussentje om haar ogen te beschermen. Scheer de linkerkant van de nek om de halsader bloot te leggen en reinig de huid met povidonjodium en 70% ethanol.
- Plaats een intraveneuze (IV) katheter in de halsader van de ooi en bevestig deze op de huid met waterdichte tape en wondclips (zie Materiaaltabel).
- Verdoof de ooien met een intraveneuze toediening van diazepam (0,15 mg/kg) en ketaminehydrochloride (16 mg/kg). Dien een IM-injectie toe met penicilline G-procaïnesuspensie (25.000 I/kg) en IV ketoprofen (2,2 mg/kg) (zie materiaaltabel).
- Scheer de incisieplaats van het schaap en de omliggende gebieden (buik, flanken en lies) met een #10 mesknipper. Om ervoor te zorgen dat de wol volledig is verwijderd, scheert u het gebied opnieuw met een #40-mes. Was het geschoren gebied met een kiemdodend reinigingsmiddel (zie Materiaaltabel) en water. Droog af met een wegwerppad.
- Bevestig de diepte van de anesthesie (bepaald en gehandhaafd door reactie op huidknijpen, hoornvliesreflex en beoordeling van de kaaktonus) en intubeer vervolgens de ooi met een endotracheale tube met een binnendiameter van 6,5-7,5 mm (zie Materiaaltabel) en zet de tube op zijn plaats. Plaats de ooi op een heftafel in de zijdelingse ligpositie en leg hem in rugligging op een operatietafel met V-top.
- Zet de ledematen van de ooi vast aan de operatietafel met chirurgische spanbanden. Breng de ooi in de Trendelenburg-positie om de druk op de foetale placenta-eenheid te verlichten.
- Bevestig een pulsoximetersonde (zie Materiaaltabel) aan de tong/het oor van de ooi om continu de oxyhemoglobineverzadiging en hartslag te controleren. Plaats een thermometer onder de tong van de ooi om de temperatuur te controleren.
- Sluit de endotracheale tube aan op het beademingscircuit van het anesthesieapparaat en start mechanische beademing terwijl u de uitgeademde CO2 bewaakt.
- Handhaaf de anesthesie door de isofluraan tijdens de operatie aan te passen tussen 2,5%-4%. Zorg ervoor dat het dier voldoende verdoofd is door in het oor te knijpen. Dien een uitgebalanceerde poly-ionische oplossing (zoutoplossing 0,9% g/v) toe in een dosis van 5 ml/kg/uur met behulp van de halsslagader die tijdens stap 3.2.1 is geplaatst.
- Voer een steriele scrub uit. Spray de buikstreek en de flanken in met povidonoplossing (10% jodiumoplossing). Schrob het gebied met een met jodium doordrenkt gaasje, beginnend bij de incisieplaats en naar buiten toe werkend, en zorg ervoor dat u niet teruggaat naar het midden nadat u naar buiten hebt geschrobd.
- Spuit vervolgens het gebied in met ethanol (70% ethanol w/v) en schrob met een in ethanol gedrenkt gaasje op dezelfde manier als het schrobben met povidon. Herhaal het hele proces drie keer. Besproei het gebied met povidonoplossing.
- Verwarm de zoutoplossing in een steriele container en breng deze op 37 °C. Bewaar dit in de buurt van de operatietafel. Sluit de cauterisatie aan (zie Tabel met materialen).
- Laat de leden van het chirurgisch team zich kleden in petten, gezichtsmaskers en schoenovertrekken, hun handen wassen (chirurgische scrub) en gesteriliseerde operatiejassen en handschoenen aantrekken. Vanaf dit punt moet een strikt steriele chirurgische praktijk worden gevolgd.
- Drapeer de buikstreek van het gesteriliseerde schaap met steriele handdoeken.
4. Chirurgische ingreep
- Exterioriseren van de foetus
- Nadat u voor voldoende diepte van de anesthesie hebt gezorgd, voert u een standaard laparotomie-incisie van 10 cm uit met een scalpel (#20-mesje) over de linea alba van de navel naar het craniale gedeelte van de uier. Houd het bloeden onder controle tijdens het maken van een incisie met een cauterisatie (vermogensinstellingen: 50 snede en 25 coagulatie).
- Maak een kleine incisie door de middellijn van de lichaamswand onder de huidincisie en open de buikholte met een Metzenbaum-schaar (zie Materiaaltabel).
- Exterioriseer de baarmoeder met de foetus door de buikwand en leg er steriele chirurgische handdoeken onder (tussen de buik van de moeder en de baarmoeder). Palpeer de baarmoeder om de foetale positie en zaadlobben te bepalen. Maak met behulp van een cauterisatie een incisie van ~10 cm door de baarmoederwand met een grote kromming over de rug van het hoofd, waarbij u zichtbare bloedvaten en placentomen vermijdt.
- Gebruik vier Babcock-klemmen (zie Materiaaltabel) om de baarmoeder- en placentamembranen vast te zetten en trek aan de Babcock-klemmen op de vier tegenoverliggende hoeken om het hoofd van de foetus zichtbaar te maken. Exterioriseer de schedelhelft van de foetus via deze incisie en bedek de foetale kop met een steriele, latexvrije handschoen gevuld met warme, steriele zoutoplossing (37 °C) om het begin van de ademhaling te voorkomen.
- Nadat u voor voldoende diepte van de anesthesie hebt gezorgd, voert u een standaard laparotomie-incisie van 10 cm uit met een scalpel (#20-mesje) over de linea alba van de navel naar het craniale gedeelte van de uier. Houd het bloeden onder controle tijdens het maken van een incisie met een cauterisatie (vermogensinstellingen: 50 snede en 25 coagulatie).
- Instrumentatie van de perivasculaire katheter van de halsslagader
- Wanneer u de kop van de foetus uit de baarmoeder haalt, laat een assistent de Babcock-tang voorzichtig rechtop houden om vruchtwaterverlies te minimaliseren. Met de nek van de foetus bloot, voert u een schuine huidincisie van 3-3,5 cm uit langs de voorste rand van de sternocleidomastoïde (SCM) -spier aan één kant van de nek in het middelste gebied en scheidt u de fascia met een muggentang.
- Verdeel het platysma en voer een dissectie uit langs de mediale rand van de SCM-spier van de pees superieur tot het niveau van de omohyoïde spier inferieur. Het intrekken van de SCM zal de halsslagader blootleggen, die oppervlakkig een dunwandige interne halsader bevat, en daaronder zal de halsslagader zich bevinden als een dikwandig vat.
- Trek de huid terug met Babcock-klemmen en voer een stompe dissectie uit om de halsslagader te bevrijden van het omliggende weefsel en het halsslagaderblad.
- Haal de flowsonde van 3 mm (zie Materiaaltabel) uit de steriele verpakking, schroef de steunplaat van de sonde los en schuif deze open om de L-beugel bloot te leggen. Til de halsslagader voorzichtig op en haak de beugel voorzichtig onder het vat vast terwijl u contact met het vat vermijdt.
- Gebruik een pincet om de beugel van de stroomsonde te sluiten door de steunplaat voorzichtig naar een gesloten positie te schuiven. Zet de beugel van de stroomsonde vast door de steunschroef van de stroomsonde vast te draaien. Om dit proces te vergemakkelijken, pakt u de uiteinden van de flowsonde voorzichtig vast met een pincet om de flowprobe te stabiliseren terwijl de schroef wordt vastgedraaid.
- Spoel de perivasculaire katheter vooraf door en plaats deze in de onmiddellijke nabijheid van de halsslagader proximaal van de stroomsonde. Zorg ervoor dat de open spleet van de perivasculaire katheter zich in de buurt van de halsslagader bevindt.
- Met een 3-0 zijden niet-resorbeerbare hechting bevestigt u de proximale en distale uiteinden van het perivasculaire systeem en de flowsonde aan het nabijgelegen interstitiële weefsel. Sluit de incisieplaats met een doorlopende hechting, sluit de foetale huid met een 3-0 zijden niet-resorbeerbare hechting en bevestig de katheters aan de huid door de hechting drie keer om de katheter te wikkelen. Verwijder de handschoen en plaats de kop van de foetus terug in de baarmoeder.
- Wanneer u de kop van de foetus uit de baarmoeder haalt, laat een assistent de Babcock-tang voorzichtig rechtop houden om vruchtwaterverlies te minimaliseren. Met de nek van de foetus bloot, voert u een schuine huidincisie van 3-3,5 cm uit langs de voorste rand van de sternocleidomastoïde (SCM) -spier aan één kant van de nek in het middelste gebied en scheidt u de fascia met een muggentang.
- Katheterisatie van foetale ledematen
- Exterioriseer de achterpoot van de foetus. Houd het been vast en draai het zijwaarts om de binnenkant van de dij te visualiseren. Reinig het gebied met steriel gaas, voer een incisie van 2 cm uit en leg de dijbeenslagader bloot. Plaats en zet de stroomsonde vast volgens een vergelijkbare procedure als bij de halsslagader en sluit vervolgens de incisie.
- Maak een incisie van 2 cm langs het mediale aspect van het scheenbeen ~0,5 cm distaal van de knie. Leg de achterste tibiale slagader (dikwandig) en vena saphena (dunwandig) bloot. Breng polyvinylkatheters (buitendiameter: 1,4 mm en binnendiameter: 0,9 mm) in de achterste tibiale slagader en vena saphena met behulp van een standaard cut-down-techniek, zoals hieronder vermeld:
- Bevrijd het vat van belang met stompe dissectie. Maak het distale deel van het vat vast met een 3-0 zijden hechting (geen naald) met behulp van een vierkante knoop met drie worpen. Plaats vooraf een tweede zijdevrije stropdas aan de proximale zijde van het vat (onder het vat), maar laat de ligatuur los. Maak met een Castroviejo-schaar (zie Materiaaltabel) een kleine, dwarse snede in het bloedvat 2 mm proximaal van de distale ligatuur. De lengte van de snede moet ~25% van de diameter van het vat zijn.
- Beperk de bloedstroom van het bloedvat door voorzichtig aan de proximale, ongebonden hechting omhoog te trekken. Vul de katheter met steriele gehepariniseerde zoutoplossing. Breng het afgeschuinde uiteinde van de katheter in en steek de punt 20 cm in het foetale vat.
- Houd de katheter op zijn plaats met een tang terwijl een assistent de proximale zijden vrijbindende hechting vastbindt om het vat aan de katheter te bevestigen; Maak het bloedvat volledig rond de ingebrachte katheter los met vierkante knopen op 2 mm van de inbrengplaats met drie worpen. Bind de distale ligatuur proximaal aan de proximale band waarmee het bloedvat aan de katheter is bevestigd.
- Sluit de huidincisie met een 3-0 zijden niet-resorbeerbare hechting met behulp van een continu hechtpatroon. Zorg ervoor dat de hechtingen rond de katheters zijn vastgebonden om te voorkomen dat de bloedstroom wordt beperkt als er aan wordt getrokken. Plaats een vooraf gespoelde katheter in de baarmoeder en bevestig deze aan de foetus door middel van een hechting met een 3-0 niet-resorbeerbare zijden hechting.
5. Het terugplaatsen van de foetus en het sluiten van de wond
- Breng de foetus terug naar de baarmoeder. Hecht de foetale vliezen met behulp van 3-0 niet-resorbeerbare zijden hechtingen met een continu vergrendelingspatroon (Cushing). Sluit de spierlaag van de baarmoeder met een 3-0 niet-resorbeerbare zijden hechtdraad.
- Breng een 18 inch roestvrijstalen chirurgische staaf subcutaan langs de buikwand tot aan het paracostale gebied. Laat het proximale uiteinde van de staaf de paracostale plaats verlaten door een incisie van 1 cm uit te voeren.
- Bevestig katheters aan het distale uiteinde van de chirurgische staaf en laat een assistent de katheters en de stroomsondekabel door de paracostale uitgangsplaats voeren door de staaf volledig door de paracostale opening te duwen.
- Zet alle katheters en flowsondekabels vast op de plaats van de paracostale incisie. Plaats met waterdichte tape en hecht de katheters aan de huid van de ooi. Hecht een plastic gaaszakje aan de buitenkant van de ooi over de katheters en sonde om de katheters op te bergen.
- Gebruik een 1-0 monofilament synthetisch resorbeerbaar hechtmateriaal om de linea alba vast te zetten met een doorlopend patroon. Zet de huidlaag vast met chirurgische nietjes.
- Stop de algehele anesthesie en extubeer de ooi zodra de larynxreflexen zijn teruggekeerd naar de normale basislijn. Laat het dier niet onbeheerd achter totdat het weer volledig bij bewustzijn is. Verplaats de ooi naar de metabolische kar zodra ze stabiel is na algemene anesthesie. Breng het dier terug naar de postoperatieve experimenteerkamer nadat het volledig hersteld is van de anesthesie.
- Postoperatieve analgetica intraveneus toedienen (10 mg/kg/dag fenylbutazon) gedurende 3 dagen. Spoel de vaatkatheters dagelijks met gehepariniseerde zoutoplossing (100 E/ml heparine in 0,9% NaCl-oplossing).
6. Postoperatieve in vivo experimenten
- Spoel de katheters elke dag met gehepariniseerde zoutoplossing (75 E/ml). Wacht 72 uur voordat u metingen uitvoert. Om de bloedstroom te meten, bevestigt u de flowsondes die met de perivasculaire flowmodule in de foetus zijn ingebracht aan PowerLab en een aangesloten computer.
OPMERKING: De opnames kunnen worden gedaan op de PowerLab-software (zie Materiaaltabel) om de bloedstroom van de halsslagader en het dijbeen te meten. Voer de nulmeting uit gedurende 30 min. - Bevestig de arteriële en vruchtwaterkatheters aan de brugversterker die is aangesloten op een analoog-naar-digitaal-omzetter (zie Materiaaltabel). Dien een bolus van 1 ml fenylefrine van 10 uM intraveneus toe aan de foetus en meet de halsslagader en de femurstroom gedurende 15 minuten. Wacht vervolgens 30 minuten of totdat de bloedstroom terugkeert naar de uitgangswaarde.
- Breng 1 ml fenylefrine van 10 uM in de perivasculaire katheter en meet de bloedstroom gedurende 15 minuten. Spoel de fenylefrine uit door 5 ml warme zoutoplossing toe te dienen via de perivasculaire katheter. Wacht vervolgens 30 minuten of totdat de bloedstroom terugkeert naar de uitgangswaarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de gelokaliseerde in vivo manipulatie van de bloedstroom te onderzoeken, werd 1 ml fenylefrine (10 μM), een α 1-AR-agonist, toegediend in de perivasculaire ruimte van de halsslagader door een geëxterioriseerde infusiekatheter om het effect op de lokale bloedstroom van de halsslagader en het effect op de systemische bloeddruk te bepalen. Figuur 1A toont een significante vermindering van de bloedstroom van de halsslagader zonder enig effect op de systemische bloeddruk bij foetale schapen op korte termijn. Figuur 1B toont dezelfde gegevens voor een te vroeg geboren foetus. Toediening van 1 ml PHE via de IV-route verhoogde de systemische bloedstroom zonder de bloedstroom van de halsslagader te beïnvloeden bij foetale schapen op korte termijn (Figuur 1C). Figuur 1D toont dezelfde gegevens voor een te vroeg geboren foetus. Daarentegen had de toediening van PHE via een perivasculaire katheter geen enkel effect bij te vroeg geboren schapen; toediening via de intraveneuze route veroorzaakte echter een significante toename van zowel de bloedstroom van de halsslagader als de systemische bloeddruk. Dit experiment demonstreert een volledig functionele perivasculaire sleeve die de bloedstroom in de halsslagader in utero kan reguleren zonder de systemische bloeddruk te beïnvloeden. De resultaten tonen aan dat te vroeg geboren foetussen niet reageren op fenylefrine-gemedieerde bloedstroomregulatie van de halsslagader; de respons is echter volwassen bij foetussen op korte termijn (Figuur 1E). Belangrijk is dat de intraveneuze toediening van PHE de bloedstroom in de halsslagader alleen verhoogde bij te vroeg geboren foetussen, zonder significant effect bij foetussen op korte termijn (Figuur 1G). De intraveneuze toediening van PHE verhoogde echter de systemische bloeddruk bij zowel premature als kortdurende foetussen (figuur 1H). De resultaten tonen ook aan dat de perivasculaire instillatie van fenylefrine geen effect had op de systemische bloeddruk (Figuur 1F).
Figuur 1: In vivo manipulatie van de bloedstroom. Een exemplarisch spoor van systemische bloeddruk en bloedstroom in de halsslagader, basismetingen en veranderingen na toediening van fenylefrine (PHE) via de perivasculaire katheter van (A) een in utero bijgedragen foetus en (B) een in utero premature foetus. Een exemplarisch spoor van systemische bloeddruk en bloedstroom in de halsslagader, nulmetingen en veranderingen na intraveneuze toediening van fenylefrine (PHE) van (C) een in utero bijdurende foetus en (D) een in utero premature foetus. De veranderingen in het (E) percentage van de bloedstroom in de halsslagader en (F) systemische bloeddruk via het perivasculaire kathetertoedieningssysteem voor te vroeg geboren en te vroeg geboren schapen worden getoond. De veranderingen in het (G) percentage van de bloedstroom in de halsslagader en (H) systemische bloeddruk via systemische toediening voor schapen op korte termijn en te vroeg geboren schapen worden getoond. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde weer. N = 4 in elke groep. *P < 0,05 door de t-toets van een student. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Momenteel bestaat er geen methode om de contractiliteit en dilatatie van bloedvaten in vivo te onderzoeken als reactie op geneesmiddelverbindingen en genmanipulatie. Als standaard in het veld wordt in vivo de bloedstroom gemeten door Doppler-flowsondes, microsferen en radioactieve moleculen zoals getritieerd water. Om de functies van de receptoren of stroomafwaartse signalering te manipuleren, worden de dieren echter geofferd en worden experimenten in vitro uitgevoerd in orgaanbaden na isolatie van arteriële segmenten. De huidige methoden bieden een manier om in vivo manipulaties van arteriële segmenten uit te voeren door chemicaliën of vectoren te introduceren om genexpressie te wijzigen. Bovendien heeft deze methode een minimaal effect op de systemische circulatie vanwege de lokale afgifte van de middelen.
De huidige experimenten tonen aan dat de toediening van fenylefrine resulteert in de vernauwing van de halsslagader met een vermindering van de bloedstroom. Het bovenstaande onderzoek verduidelijkt de rol van alfa-adrenerge receptoren bij het reguleren van de bloedtoevoer van de halsslagader naar de hersenen. Deze techniek kan worden gebruikt om het effect van verschillende farmacologische verbindingen op de bloedstroom in realtime bij levende foetussen te onderzoeken. De perivasculaire katheter kan ook worden gebruikt om lentivirus in de perivasculaire ruimte in te brengen, dat wordt ingenomen door het vaatstelsel, wat resulteert in het uitschakelen of overexpressie van het gewenste signaaleiwit of de gewenste receptor.
Decennialang hebben orgaan- en weefselbaden nuttige gegevens opgeleverd over de contractiliteit van bloedvaten 6,8,9. Deze studies zijn echter ex vivo, wat vragen oproept over de reproduceerbaarheid in vivo en betekent dat continue metingen niet kunnen worden uitgevoerd. Om deze beperking te overwinnen, onderzoekt deze innovatieve aanpak de bloedstroom van de halsslagader in vivo. Een verdere vooruitgang in deze methodologie omvat de toepassing van genetische modulatie met behulp van virusafgiftebenaderingen, waardoor arteriële segmenten genetisch kunnen worden gewijzigd om genexpressie te upreguleren en te downreguleren door shRNA of CRISPR/Cas9 af te leveren.
De cruciale stap in het protocol is het plaatsen van de perivasculaire katheter parallel aan het bloedvat in de directe nabijheid. Om dit te laten werken, moet men de diameter van de beoogde slagader kennen. Daarnaast is het ontwikkelen van een goede sleeve belangrijk. Men kan de huls naast de te moduleren slagader plaatsen in plaats van eromheen. Dit zorgt ook voor lokale levering van de chemicaliën en targetingmiddelen.
De beperking van de methode is dat deze alleen een segment van de slagader reguleert en dat de resultaten met betrekking tot de doorbloeding van organen of weefsels zorgvuldig moeten worden geïnterpreteerd. Het kan nodig zijn om de lengte van de sleeve en de hoeveelheid chemicaliën te veranderen om het gewenste effect te bereiken. De methode heeft brede toepassingen bij het moduleren van genregulatie bij levende foetussen. Dit kan worden aangepast om de genfunctie en -expressie in een deel van elk weefsel te moduleren. Bovendien kan de methode worden toegepast om genexpressie in een volwassen organisme te moduleren.
Hoewel er andere methoden zijn om de bloedstroom in vivo te meten, zoals het gebruik van transsone flowsondes10, laserdoppler11 en microsferen12, maakt geen van deze methoden het mogelijk om het lokale effect van de geneesmiddelen op de bloedstroom in het arteriële segment te onderzoeken in tegenstelling tot de systemische effecten van de interventie. De huidige methode is dus uniek, omdat het de lokale bloedstroom kan meten en moduleren zonder systemische effecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen.
Acknowledgments
Voor deze studies werden intramurale fondsen van de Universiteit van Arizona gebruikt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A.
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
