Summary
本方案描述了一种在 子宫 内发育的胎儿中血管周围递送药物和基因表达修饰剂的方法。重要的是，药物/药物对血流的影响可以通过怀孕的进展来衡量。
Abstract
生物体在全身血压 （BP） 突然飙升时保持恒定的血流到大脑的能力称为脑自动调节 （CAR），它发生在颈动脉中。与足月新生儿相比，早产儿无法因全身血压升高而减少脑血流量 （CBF）。在早产儿中，这会使脆弱的脑血管暴露在高灌注压力下，导致其破裂和脑损伤。使用线肌图的 离体 研究表明，来自近足月胎儿的颈动脉会因肾上腺素能 α1 受体的激活而收缩。这种反应在早产儿中减弱。因此，为了检查α1-AR 在体内的作用，这里介绍的是一种创新方法，用于确定药物在妊娠发育过程中对绵羊胎儿 体内 颈动脉段的影响。所提供的数据演示了同时测量胎儿血流量和血压。血管周围输送系统可用于进行为期数天的长期研究。这种方法的其他应用可能包括病毒递送系统，以改变颈动脉段中基因的表达。这些方法可以应用于 子宫内 生长的生物体中的其他血管以及成年生物体。
Introduction
出生会给胎儿带来压力，儿茶酚胺（主要的压力荷尔蒙1,2）水平显着增加。这会提高全身血压，如果这种压力通过颈动脉传递到脆弱的脑毛细血管，这可能导致其破裂3,4,5。足月胎儿颈动脉收缩可防止全身血压激增到达大脑。然而，这种机制在早产儿中没有发展，这是导致早产儿脑损伤的可能性显着增加的原因 4,5。
目前，尚无合适的方法来检查发育中的胎儿调节颈动脉血流的途径的成熟度。从基础科学和临床角度来看，这些关于颈动脉血流和血管反应性的研究都至关重要。目前，为了确定参与调节动脉收缩力的分子途径，标准方法涉及在死后分离动脉节段。然后，使用金属丝肌图进行实验，以确定不同药理学分子的血管收缩力，这些药理学分子定义了参与动脉收缩力的调节途径6,7。值得注意的是，由于颈动脉上游和下游的血流调节，离体研究结果无法完全复制体内环境。因此，本研究旨在开发一种技术，可以确定血管反应性化学物质或药物对体内动脉血流的影响。
本文中描述的血管周围递送方法提供了一种 体内 方法来研究信号通路的药理学或遗传操作对不同动脉节段的影响。使用这种方法，可以操纵胎儿血压和颈动脉血流量。此外，还展示了绵羊胎儿的实验，用于研究信号分子对发育中的胎儿的影响。希望所提供的详细方法将导致血流研究领域的新研究，特别是与胎儿生理学和病理学相关的研究。
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Protocol
对于本研究，动物实验已获得亚利桑那大学动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了一只 2-4 岁之间的怀孕哥伦比亚-朗布依埃母羊。这些动物是从亚利桑那大学绵羊部门获得的。
1. 动物饲养
- 从任何绵羊牧场获取动物。
- 在胎龄 （dGA） 105 天± 5 天至 137 天± 5 天时将母羊运送到实验室。在环境湿度下将绵羊保持在22°C±1°C的温度。随意提供紫花苜蓿颗粒（见材料表）、盐和水。
2.材料准备
- 构建血管周围导管系统。
- 将 4 英尺 Tygon 管的一端连接到 2 厘米的歧管泵管 （MPT）（参见 材料表）。将 2 cm MPT 的另一端连接到另一个 4 英尺的 Tygon 管上。
- 在 MPT 中开一个小缝，以便液体/药物可以进入血管周围空间。
- 使用气体灭菌方法对流量探头（见 材料表）、导管和小螺丝刀进行灭菌。
3.术前动物准备
- 获得机构动物护理和使用委员会的动物实验批准。
- 手术前，让母羊吃 零 （NPO） 食物 24 小时，让 NPO 水保持 16 小时。手术当天，用垫子包裹母羊的脸以保护她的眼睛。剃掉颈部左侧以露出颈静脉，并使用聚维酮碘和 70% 乙醇清洁皮肤。
- 在母羊的颈静脉中放置一根静脉内 （IV） 导管，并用防水胶带和伤口夹将其固定在皮肤上（见 材料表）。
- 用静脉注射地西泮（0.15mg / kg）和盐酸氯胺酮（16mg / kg）麻醉母羊。肌内注射青霉素 G 普鲁卡因混悬液 （25,000 I/kg） 和静脉注射酮洛芬 （2.2 mg/kg）（见 材料表）。
- 用 #10 刀片剪剃掉绵羊的切口部位和周围区域（腹部、侧面和腹股沟）。为确保完全去除羊毛，请使用 #40 刀片重新剃须该区域。用杀菌清洁剂（见 材料表）和水清洗剃光区域。用一次性垫子擦干。
- 确认麻醉深度（通过对皮肤捏合、角膜反射和下颌张力评估的反应来确定和维持），然后用内径为 6.5-7.5 mm 的气管插管插管（见 材料表），并将管固定到位。将母羊放在侧卧位的升降台上，然后转移到仰卧位的V型手术台上。
- 用手术系带将母羊的四肢固定在V型顶手术台上。将母羊带入特伦德伦堡体位，以减轻胎盘单位的压力。
- 将脉搏血氧仪探头（见 材料表）连接到母羊的舌头/耳朵上，以持续监测氧合血红蛋白饱和度和心率。将温度计放在母羊的舌头下以监测温度。
- 将气管插管连接到麻醉机的呼吸回路，在监测呼出的 CO2 的同时启动机械通气。
- 在整个手术过程中，通过将异氟醚调整在 2.5%-4% 之间来维持麻醉。通过捏耳朵确保动物得到充分麻醉。使用步骤 3.2.1 中放置的颈静脉导管以 5 mL/kg/h 的速度施用平衡的多离子（盐水 0.9% w/v）溶液。
- 进行无菌擦洗。用聚维酮溶液（10%碘溶液）喷洒腹部和侧面。用碘浸过的纱布从切口部位开始向外擦洗该区域，确保向外擦洗后不要回到中心。
- 接下来，用乙醇（70%乙醇w / v）喷洒该区域，并用乙醇浸泡的纱布擦洗，与用聚维酮擦洗的方式类似。重复整个过程三次。用聚维酮溶液喷洒该区域。
- 在无菌容器中加热生理盐水，并将其降至37°C。 把它放在手术台附近。连接烧灼器（见 材料表）。
- 让手术团队成员戴上帽子、口罩和鞋套，洗手（手术擦洗），并穿上消毒的手术衣和手套。从现在开始，必须遵循严格的无菌手术实践。
- 用无菌毛巾覆盖消毒的绵羊腹部。
4. 外科手术
- 胎儿外部化
- 在确保足够的麻醉深度后，使用手术刀（#20 刀片）在从脐部到乳房颅骨部分的白线上进行 10 cm 的标准剖腹切口。用烧灼术切开切口时控制出血（功率设置：50 切口和 25 凝固）。
- 在皮肤切口下方的体壁中线做一个小切口，然后用梅岑鲍姆剪刀打开腹腔（见 材料表）。
- 通过腹壁将包含胎儿的子宫外部化，同时将无菌手术毛巾放在下面（母体腹部和子宫之间）。触诊子宫以确定胎儿位置和子叶。使用烧灼术，在子宫壁上做一个 ~10 厘米的切口，在头部背面有一个大的弯曲，避免任何可见的血管和胎盘。
- 使用四个 Babcock 夹子（见 材料表）固定子宫和胎盘膜，并在四个相对角处拉动 Babcock 夹子，使胎儿头部可见。通过该切口将胎儿的颅半部外部化，并用充满温热无菌盐水（37°C）的无菌非乳胶手套覆盖胎儿头部，以防止呼吸开始。
- 在确保足够的麻醉深度后，使用手术刀（#20 刀片）在从脐部到乳房颅骨部分的白线上进行 10 cm 的标准剖腹切口。用烧灼术切开切口时控制出血（功率设置：50 切口和 25 凝固）。
- 颈动脉血管周围导管的器械
- 从子宫中取出胎头时，让助手轻轻握住 Babcock 镊子直立，以尽量减少羊水流失。在胎儿颈部暴露的情况下，在颈部中部区域一侧的胸锁乳突肌 （SCM） 前缘进行 3-3.5 厘米的斜皮肤切口，并用蚊钳分离筋膜。
- 将颈阔肌分开，并沿SCM肌肉的内侧缘从其肌腱上方解剖到下方舌骨肌的水平。缩回 SCM 将暴露颈动脉板，颈动脉板表面包含一条薄壁颈内静脉，其下方将是颈动脉作为厚壁血管。
- 用 Babcock 钳缩回皮肤，并进行钝解剖以将颈动脉从周围组织和颈动脉片中释放出来。
- 从无菌包装中取出 3 mm 流量探头（参见 材料表），拧下探头的背板，然后将其滑开以露出 L 型支架。小心地抬起颈动脉，轻轻地钩住血管下方的支架，同时避免与血管接触。
- 使用镊子将背板轻轻滑动到关闭位置，以关闭流量探头支架。通过拧紧流量探头的背衬螺钉来固定流量探头支架。为了简化此过程，请在拧紧螺钉时用镊子轻轻夹住流量探头的末端以稳定流量探头。
- 预先冲洗血管周围导管，并将其放置在靠近血流探头的颈动脉附近。确保血管周围导管的开口切口靠近颈动脉。
- 用 3-0 丝不可吸收缝合线，将血管周围系统的近端和远端以及流动探头固定到附近的间质组织。使用连续缝合切口部位，用3-0丝不可吸收缝合线闭合胎儿皮肤，并通过将缝合线缠绕导管三次将导管固定在皮肤上。取下手套，将胎头放回子宫内。
- 从子宫中取出胎头时，让助手轻轻握住 Babcock 镊子直立，以尽量减少羊水流失。在胎儿颈部暴露的情况下，在颈部中部区域一侧的胸锁乳突肌 （SCM） 前缘进行 3-3.5 厘米的斜皮肤切口，并用蚊钳分离筋膜。
- 胎儿肢体导尿术
- 将胎儿的后腿外部化。握住腿，将其侧向转动以可视化大腿内侧区域。用无菌纱布清洁该区域，切开 2 厘米，露出股动脉。按照与颈动脉类似的程序放置并固定流量探头，然后闭合切口。
- 沿胫骨内侧切开 2 厘米的切口 ~膝盖远端 0.5 厘米。暴露胫后动脉（厚壁）和隐静脉（薄壁）。使用标准切割技术将聚乙烯导管（外径：1.4 毫米，内径：0.9 毫米）插入胫后动脉和隐静脉，如下所述：
- 通过钝解剖释放感兴趣的血管。用 3-0 丝缝合线（无针）结扎血管的远端部分，使用方形结和三次投掷。在血管的近端（血管下方）预先放置第二条无丝领带，但不要系结扎。使用Castroviejo剪刀（见 材料表），在远端结扎线近端2 mm的血管上做一个小的横向切口。切割的长度应为容器直径的 ~25%。
- 通过轻轻向上拉近端解开的缝合线来限制血管血流。用无菌肝素盐水填充导管。插入导管的斜面端，并将尖端推进 20 厘米进入胎儿血管。
- 用镊子将导管固定到位，同时助手将近端丝自由系线绑在一起，将血管固定到导管上;使用距离插入部位 2 mm 的方结将血管完全绑在插入的导管周围，并投掷三次。将远端结扎带绑在将血管固定到导管的近端系带上。
- 使用连续缝合模式的 3-0 丝绸不可吸收缝合线闭合皮肤切口。确保缝合线绑在导管周围，以避免在拉扯时限制血流。将预冲洗的导管放入子宫中，并使用 3-0 不可吸收的丝绸缝合线通过缝合线将其固定在胎儿上。
5.将胎儿放回原处并闭合伤口
- 将胎儿送回子宫。使用具有连续锁定（库欣）图案的 3-0 不可吸收丝缝合线缝合胎膜。使用 3-0 不可吸收的丝绸缝合线闭合子宫肌肉层。
- 将一根 18 英寸的不锈钢手术棒沿腹壁皮下插入直至肋旁区域。通过进行 1 厘米的切口，让杆的近端离开肋旁部位。
- 将导管连接到手术棒的远端，并让助手将导管和流探针电缆完全推过肋旁开口，从而将导管和流探针电缆穿过肋旁出口部位。
- 将所有导管和流量探头电缆固定在肋旁切口部位。用防水胶带放置，并将导管缝合到母羊的皮肤上。将塑料网袋缝合到母羊的外部，穿过导管和探针以储存导管。
- 使用 1-0 单丝合成可吸收缝合材料，以连续图案固定白线。用手术钉固定皮肤层。
- 停止全身麻醉，一旦喉反射恢复到正常基线，就拔管母羊。在动物完全恢复意识之前，不要让它无人看管。一旦母羊在全身麻醉后稳定，就将其移至代谢车上。从麻醉中完全恢复后，将动物送回术后实验室。
- 术后静脉注射镇痛药（10 mg/kg/天保泰松），持续 3 天。每天用肝素化盐水溶液（100 U/mL肝素在0.9%NaCl溶液中）冲洗血管导管。
6. 术后 体内 实验
- 每天用肝素盐水（75 U / ml）冲洗导管。等待 72 小时后再进行任何测量。要测量血流，请将插入胎儿的血流探头与血管周围血流模块一起连接到 PowerLab 和连接的计算机。
注意：可以在 PowerLab 软件上进行记录（参见 材料表）以测量颈动脉和股动脉血流量。进行 30 分钟的基线测量。 - 将动脉导管和羊膜导管连接到连接到模数转换器的桥放大器上（参见 材料表）。静脉内给予胎儿 1 mL 推注 10 uM 去氧肾上腺素，并测量颈动脉和股骨血流量 15 分钟。然后，等待 30 分钟或直到血流恢复到基线。
- 将 1 mL 10 uM 去氧肾上腺素注入血管周围导管，并测量血流量 15 分钟。通过血管周围导管给予 5 mL 温盐水来洗掉去氧肾上腺素。然后，等待 30 分钟或直到血流恢复到基线。
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Representative Results
为了检查血流的局部 体内 操作，将 1 mL 去氧肾上腺素 （10 μM），一种α1-AR 激动剂，通过外部输注导管施用到颈动脉血管周围空间，以确定对局部颈动脉血流的影响和对全身血压的影响。 图1A 显示颈动脉血流量显著减少，对近足月胎羊的全身血压没有任何影响。 图1B 显示了早产儿的相同数据。通过静脉注射途径给予 1 mL PHE 可增加全身血流量，而不会影响近足月胎羊的颈动脉血流量（图 1C）。 图1D 显示了早产儿的相同数据。相比之下，通过血管周围导管施用PHE对早产羊没有任何影响;然而，通过静脉内途径给药导致颈动脉血流量和全身血压显着增加。该实验展示了一种功能齐全的血管周围套管，可以在不影响全身血压的情况下调节 子宫 内颈动脉的血流。结果显示，早产儿对去氧肾上腺介导的颈动脉血流调节无反应;然而，这种反应在近足月胎儿中已经成熟（图1E）。重要的是，静脉注射PHE仅增加早产儿的颈动脉血流量，对近足月胎儿没有显着影响（图1G）。然而，PHE的静脉给药提高了早产儿和近足月胎儿的全身血压（图1H）。结果还表明，去氧肾上腺素的血管周围滴注对全身血压没有影响（图1F）。
图1：体内血流操作。通过血管周围导管给药去氧肾上腺素 （PHE） 后，来自 （A） 子宫内近足月胎儿和 （B） 子宫内早产儿的系统血压和颈动脉血流基线测量和变化的示例性痕迹。静脉注射去氧肾上腺素 （PHE） 后全身血压和颈动脉血流量基线测量和变化的示例性痕迹 （C） 子宫内近足月胎儿和 （D） 子宫内早产儿。显示了近足月和早产绵羊通过血管周围导管输送系统的颈动脉血流量 （E） 百分比和 （F） 全身血压的变化。显示了近足月和早产绵羊通过全身给药的颈动脉血流量 （G） 百分比和 （H） 全身血压的变化。误差线表示平均值的标准误差。每组 N = 4。*P < 0.05 通过学生的 t 检验。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
目前，尚无方法检查 体内 血管收缩和扩张对药物化合物和基因操作的反应。作为该领域的标准， 体内 血流通过多普勒流探头、微球和放射性分子（如氚化水）进行测量。然而，为了操纵受体的功能或下游信号传导，动物被处死，并在分离动脉节段后在器官浴 中体外 进行实验。目前的方法提供了一种通过引入化学物质或载体来修饰基因表达来对动脉节段进行 体内 操作的方法。此外，由于药剂的局部递送，这种方法对体循环的影响最小。
目前的实验表明，去氧肾上腺素的施用导致颈动脉收缩，血流量减少。上述研究阐明了α-肾上腺素能受体在调节颈动脉血流到大脑中的作用。该技术可用于实时检查不同药理学化合物对活胎儿血流的影响。血管周围导管还可用于将慢病毒滴入血管周围空间，该空间被脉管系统吸收，以导致所需信号蛋白或受体的敲低或过表达。
几十年来，器官和组织浴提供了有关血管收缩力的有用数据6,8,9。然而，这些研究是离体进行的，这引发了关于体内可重复性的问题，这意味着无法进行连续测量。为了克服这一局限性，这种创新方法检查体内颈动脉血流。该方法的另一个进步将包括采用使用病毒递送方法的遗传调节，这将允许通过递送shRNA或CRISPR / Cas9对动脉片段进行基因改变，以上调和下调基因表达。
该方案中的关键步骤是将血管周围导管平行于血管放置在附近。为此，需要知道目标动脉的直径。此外，开发合适的袖子也很重要。可以将套筒放置在要调节的动脉附近，而不是围绕它。这也将提供化学品和靶向剂的本地交付。
该方法的局限性在于它只能调节动脉的一部分，并且应仔细解释有关器官或组织血流的结果。可能需要改变套筒的长度和化学品的量以达到预期的效果。该方法在活胎基因调控方面具有广泛的应用。这可以适应于调节任何组织的一部分中的基因功能和表达。此外，该方法可用于调节成年生物体中的基因表达。
尽管有其他方法可以测量 体内 血流，例如使用跨音速血流探头10、激光多普勒11和微球12，但这些方法都不允许检查药物对动脉段血流的局部影响，而不是干预的全身效应。因此，目前的方法是独一无二的，因为它可以测量和调节局部血流，而不会产生任何全身影响。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
亚利桑那大学的校内资金用于这些研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
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