Summary
본 프로토콜은 자궁 내 발달 태아에서 약물 및 유전자 발현 변형제를 혈관 주위로 전달하는 방법을 설명합니다. 중요한 것은 약물/약제가 혈류에 미치는 영향은 임신의 진행과 함께 측정할 수 있다는 것입니다.
Abstract
전신 혈압(BP)의 갑작스런 급증에 대응하여 뇌로 가는 혈류를 일정하게 유지하는 유기체의 능력은 경동맥에서 발생하는 대뇌 자가조절(CAR)로 알려져 있습니다. 만삭 신생아와 달리 조산 신생아는 전신 혈압 증가에 반응하여 뇌 혈류(CBF)를 감소시킬 수 없습니다. 조산아의 경우, 이로 인해 연약한 뇌혈관이 높은 관류압에 노출되어 파열과 뇌 손상이 발생합니다. 와이어 근근 조영술을 사용한 생체 외 연구에서 만삭 태아의 경동맥이 아드레날린성 알파1 수용체의 활성화에 반응하여 수축하는 것으로 나타났습니다. 이 반응은 조산아에서 무뎌진다. 따라서 생체 내에서 alpha1-AR의 역할을 조사하기 위해 여기에 제시된 것은 임신 발달 진행 중 난소 태아의 생체 내 경동맥 분절에 대한 약물의 효과를 결정하는 혁신적인 접근 방식입니다. 제시된 데이터는 태아의 혈류량과 혈압을 동시에 측정한 것입니다. 혈관 주위 전달 시스템은 며칠에 걸친 장기 연구를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 추가 응용 분야에는 경동맥 분절에서 유전자 발현을 변경하는 바이러스 전달 시스템이 포함될 수 있습니다. 이러한 방법은 자궁 에서 성장하는 유기체의 다른 혈관뿐만 아니라 성인 유기체에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
출산은 태아에게 스트레스를 유발하며, 주요 스트레스 호르몬인 카테콜아민 1,2의 수치가 상당히 증가합니다. 이것은 전신 혈압을 높이고, 이 압력이 경동맥을 통해 연약한 뇌 모세혈관으로 전달되면 파열로 이어질 수 있습니다 3,4,5. 전신 혈압의 급증은 만삭 태아의 경동맥 수축에 의해 뇌에 도달하는 것을 방지합니다. 그러나 이 메커니즘은 미숙아에서는 발달되지 않으며, 이는 조산아에서 뇌 손상의 가능성이 현저히 높아지는 원인이 된다 4,5.
현재, 발달 중인 태아와 함께 경동맥 혈류를 조절하는 경로의 성숙을 조사할 수 있는 적절한 방법은 존재하지 않는다. 경동맥 혈류와 혈관 반응성에 대한 이러한 연구는 기초 과학과 임상 관점 모두에서 매우 중요합니다. 현재 동맥 수축 조절에 관여하는 분자 경로를 결정하기 위해 표준 방법은 사후 동맥 분절을 분리하는 것입니다. 그런 다음 실험은 동맥 수축력과 관련된 조절 경로를 정의하는 다양한 약리학적 분자의 혈관 수축성을 결정하기 위해 와이어 근조영술을 사용하여수행됩니다 6,7. 주목할 점은, 생체 외 연구 결과는 경동맥의 상류 및 하류의 혈류 조절 때문에 생체 내 환경을 완전히 복제할 수 없다는 것입니다. 따라서, 본 연구는 생체 내 동맥의 혈류에 대한 혈관 반응성 화학물질 또는 약제의 효과를 결정할 수 있는 기술을 개발하는 것을 목표로 하였다.
이 논문에서 설명하는 혈관 주위 전달 방법론은 다양한 동맥 분절에 대한 신호 전달 경로의 약리학적 또는 유전적 조작의 효과를 연구하기 위한 생체 내 접근 방식을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 태아 혈압과 경동맥 혈류를 조작할 수 있습니다. 또한 양 태아를 대상으로 한 실험은 발달 중인 태아에서 신호 분자의 효과를 연구하기 위해 입증되었습니다. 제공된 상세한 방법론이 혈류 연구 분야, 특히 태아 생리학 및 병리학과 관련된 새로운 연구로 이어지기를 바랍니다.
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Protocol
본 연구의 경우, 애리조나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회로부터 동물 실험에 대한 승인을 받았습니다. 2-4세 사이의 임신한 Columbia-Rambouillet 암양 한 마리가 본 연구에 사용되었습니다. 동물들은 애리조나 대학교 양 부대에서 얻었다.
1. 동물 관리
- 양 목장에서 동물을 얻으십시오.
- 암양을 105일 ± 5일에서 137일 ± 재태 연령(dGA) 5일에 실험실로 이송합니다. 양은 22°C ± 주변 습도에서 1°C의 온도로 유지하십시오. 알팔파 펠릿( 재료 표 참조), 소금 및 물을 제공합니다.
2. 재료 준비
- 혈관 주위 카테터 시스템을 구축합니다.
- Tygon 튜빙 4피트의 한쪽 끝을 2cm 매니폴드 펌프 튜빙(MPT)에 연결합니다( 재료 표 참조). 2cm MPT의 다른 쪽 끝을 다른 4피트 Tygon 튜브에 부착합니다.
- 액체/약제가 혈관 주위 공간으로 나올 수 있도록 MPT에 작은 구멍을 만듭니다.
- 가스 멸균 방법을 사용하여 유량 프로브( 재료 표 참조), 카테터 및 작은 드라이버를 멸균합니다.
3. 수술 전 동물 준비
- Institutional Animal Care and Use Committee로부터 동물 실험에 대한 승인을 받습니다.
- 수술 전에 암양은 24시간 동안 NPO(nil per os ) 사료를 먹고 16시간 동안 NPO 물을 먹게 하십시오. 수술 당일에는 눈을 보호하기 위해 패드로 암양의 얼굴을 감쌉니다. 목의 왼쪽을 면도하여 경정맥을 노출시키고 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 사용하여 피부를 청소합니다.
- 암양의 경정맥에 정맥(IV) 카테터를 삽입하고 방수 테이프와 감기 클립으로 피부에 고정합니다( 재료 표 참조).
- 디아제팜(0.15mg/kg)과 케타민 염산염(16mg/kg)의 IV 투여로 암양을 마취시킵니다. 페니실린 G 프로카인 현탁액(25,000 I/kg) 및 IV 케토프로펜(2.2 mg/kg)의 IM 주사를 투여합니다( 자료표 참조).
- 양의 절개 부위와 주변 부위(복부, 옆구리, 사타구니)를 #10 면도날로 면도합니다. 양모가 완전히 제거되었는지 확인하려면 #40 면도날로 해당 부위를 다시 면도하십시오. 면도 부위를 살균 클렌저( 재료 표 참조)와 물로 씻으십시오. 일회용 패드로 말리십시오.
- 마취 깊이를 확인한 다음(피부 꼬집음, 각막 반사 및 턱 긴장도 평가에 대한 반응에 의해 결정 및 유지됨) 내경 6.5-7.5mm의 기관내관( 재료 표 참조)으로 암양을 삽관하고 튜브를 제자리에 고정합니다. 암양을 옆으로 누운 자세의 리프트 테이블에 놓고 누운 자세의 V-top 수술 테이블로 옮깁니다.
- 수술용 타이다운으로 암양의 팔다리를 V-top 수술대에 고정합니다. 암양을 Trendelenburg 위치로 가져와 태아-태반 단위에 가해지는 압력을 완화합니다.
- 맥박 산소 측정기 프로브( 재료 표 참조)를 암양의 혀/귀에 부착하여 산소 헤모글로빈 포화도와 심박수를 지속적으로 모니터링합니다. 암양의 혀 아래에 온도계를 놓고 온도를 모니터링합니다.
- 기관내관을 마취기의 호흡 회로에 연결하고 만료된 CO2를 모니터링하면서 기계적 환기를 시작합니다.
- 수술 내내 이소플루란을 2.5%-4% 사이로 조정하여 마취를 유지합니다. 귀를 꼬집어 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 3.2.1단계에서 삽입된 경정맥 카테터를 사용하여 5mL/kg/h에서 균형 잡힌 폴리이온(식염수 0.9% w/v) 용액을 투여합니다.
- 멸균 스크럽을 수행합니다. 복부와 옆구리에 포비돈 용액(10% 요오드 용액)을 뿌린다. 절개 부위에서 시작하여 바깥쪽으로 요오드를 적신 거즈로 해당 부위를 문지르고 바깥쪽으로 문지른 후 중앙으로 돌아가지 않도록 합니다.
- 그런 다음 해당 부위에 에탄올(70% 에탄올 w/v)을 뿌리고 포비돈으로 문지르는 것과 유사한 방식으로 에탄올을 적신 거즈로 문지릅니다. 전체 과정을 세 번 반복합니다. 해당 부위에 포비돈 용액을 뿌립니다.
- 멸균 용기에 식염수를 넣고 37°C로 올립니다. 수술대 근처에 보관하십시오. 소작을 연결합니다( 재료 표 참조).
- 수술 팀원들에게 모자, 안면 마스크, 신발 커버를 착용하고, 손을 씻고(수술용 스크럽), 멸균된 수술 가운과 장갑을 착용하게 합니다. 이 시점부터 엄격한 멸균 수술 관행을 따라야 합니다.
- 멸균 된 양의 복부 부위를 멸균 수건으로 덮으십시오.
4. 수술 절차
- 태아의 외면화
- 적절한 마취 깊이를 확보한 후 메스(#20 블레이드)를 사용하여 배꼽에서 유방의 두개골 부분까지 linea alba 위에 10cm 표준 개복술 절개를 수행합니다. 소작으로 절개하면서 출혈을 조절합니다 (파워 설정 : 절제 50 개, 응고 25 개).
- 피부 절개 아래 체벽의 정중선을 통해 작은 절개를 하고 Metzenbaum 가위를 사용하여 복강을 엽니다( 재료 표 참조).
- 태아가 있는 자궁을 복벽을 통해 바깥쪽으로 만들고 그 아래(산모의 복부와 자궁 사이)에 멸균 수술용 수건을 놓습니다. 자궁을 촉진하여 태아의 위치와 자엽을 확인합니다. 소작기를 사용하여 혈관과 태반이 보이지 않도록 머리 등쪽에 큰 곡률로 자궁벽을 ~10cm 절개합니다.
- 4개의 Babcock cl을 사용하십시오.amps( 재료 표 참조) 자궁과 태반막을 고정하고 Babcock cl을 당깁니다.amp네 개의 반대쪽 모서리에서 태아의 머리가 보이도록 합니다. 이 절개를 통해 태아의 두개골 절반을 바깥쪽으로 내밀고 따뜻한 멸균 식염수(37°C)로 채워진 멸균 비라텍스 장갑으로 태아의 머리를 덮어 호흡이 시작되지 않도록 합니다.
- 적절한 마취 깊이를 확보한 후 메스(#20 블레이드)를 사용하여 배꼽에서 유방의 두개골 부분까지 linea alba 위에 10cm 표준 개복술 절개를 수행합니다. 소작으로 절개하면서 출혈을 조절합니다 (파워 설정 : 절제 50 개, 응고 25 개).
- 경동맥 혈관 주위 카테터의 기구
- 자궁에서 태아의 머리를 제거할 때 조수가 Babcock 겸자를 부드럽게 똑바로 세워 양수 손실을 최소화하도록 합니다. 태아의 목이 노출된 상태에서 목 한쪽 중간 부위의 흉쇄유돌근(SCM) 전방 경계를 따라 3-3.5cm의 비스듬한 피부 절개를 하고 모기 집게로 근막을 분리합니다.
- platysma를 나누고, SCM 근육의 내측 경계를 따라 힘줄에서 하부 오모설근 수준까지 절개합니다. SCM을 수축시키면 표면적으로 얇은 벽의 내부 경정맥을 포함하는 경동맥 시트가 노출되고 그 아래에는 두꺼운 벽의 혈관으로 경동맥이 노출됩니다.
- Babcock 클램프로 피부를 수축시키고 뭉툭한 박리를 수행하여 주변 조직과 경동맥 시트에서 경동맥을 제거합니다.
- 멸균 팩에서 3mm 유량 프로브( 재료 표 참조)를 꺼내 프로브의 백킹 플레이트를 풀고 밀어서 열어 L-브래킷을 노출시킵니다. 경동맥을 조심스럽게 들어 올리고 혈관과의 접촉을 피하면서 혈관 아래에 브래킷을 부드럽게 연결합니다.
- 집게를 사용하여 백킹 플레이트를 닫힌 위치로 부드럽게 밀어 유량 프로브 브래킷을 닫습니다. 유량 프로브의 백킹 나사를 조여 유량 프로브 브래킷을 고정합니다. 이 과정을 용이하게 하려면 나사를 조이는 동안 유량 프로브를 안정화하기 위해 집게로 유량 프로브의 끝을 부드럽게 잡습니다.
- 혈관 주위 카테터를 미리 세척하고 플로우 프로브에 근접한 경동맥 근처에 놓습니다. 혈관 주위 카테터의 열린 슬릿이 경동맥에 매우 근접해 있는지 확인합니다.
- 3-0 실크 비흡수성 봉합사를 사용하여 혈관 주위 시스템의 근위 및 원위 끝과 플로우 프로브를 근처의 간질 조직에 고정합니다. 연속 봉합으로 절개 부위를 봉합하고 3-0 실크 비흡수성 봉합사로 태아 피부를 봉합하고 카테터 주위에 봉합사를 3회 감아 카테터를 피부에 고정합니다. 장갑을 벗고 태아의 머리를 자궁에 다시 넣습니다.
- 자궁에서 태아의 머리를 제거할 때 조수가 Babcock 겸자를 부드럽게 똑바로 세워 양수 손실을 최소화하도록 합니다. 태아의 목이 노출된 상태에서 목 한쪽 중간 부위의 흉쇄유돌근(SCM) 전방 경계를 따라 3-3.5cm의 비스듬한 피부 절개를 하고 모기 집게로 근막을 분리합니다.
- 태아 사지 카테터 삽입
- 태아의 뒷다리를 바깥쪽으로 만듭니다. 다리를 잡고 옆으로 돌려 허벅지 안쪽 부분을 시각화합니다. 멸균 거즈로 해당 부위를 청소하고 2cm 절개를 실시하여 대퇴 동맥을 노출시킵니다. 경동맥과 유사한 절차에 따라 플로우 프로브를 놓고 고정한 다음 절개 부위를 닫습니다.
- 경골의 내측을 따라 무릎 원위~0.5cm를 따라 2cm 절개합니다. 후방 경골 동맥(두꺼운 벽)과 복재정맥(얇은 벽)을 노출시킵니다. 폴리비닐 카테터(외경: 1.4mm, 내경: 0.9mm)를 아래에 언급된 표준 절단 기술을 사용하여 후방 경골 동맥과 복재정맥에 삽입합니다.
- 뭉툭한 해부로 관심 혈관을 풀어주세요. 세 번 던지는 사각형 매듭을 사용하여 3-0 실크 봉합사(바늘 없음)로 혈관의 말단 부분을 결찰합니다. 두 번째 실크가 없는 넥타이를 혈관의 근위부(혈관 아래)에 미리 놓지만 합자는 묶지 않은 상태로 둡니다. Castroviejo 가위 ( 재료 표 참조)를 사용하여 원위 합자에 근접 2mm 떨어진 혈관을 가로 방향으로 작게 자릅니다. 절단 길이는 용기 직경의 ~25%여야 합니다.
- 근위부의 풀린 봉합사를 부드럽게 잡아당겨 혈관 혈류를 제한합니다. 카테터를 멸균 헤파린 처리 식염수로 채웁니다. 카테터의 비스듬한 끝을 삽입하고 팁을 태아의 혈관에 20cm 전진시킵니다.
- 보조자가 혈관을 카테터에 고정하기 위해 근위 실크 프리 타이 봉합사를 묶는 동안 겸자로 카테터를 제자리에 고정합니다. 삽입 부위에서 2mm 떨어진 정사각형 매듭을 사용하여 삽입된 카테터 주위에 혈관을 완전히 결찰합니다. 근위 원위 결대를 근위 넥타이에 묶어 혈관을 카테터에 고정합니다.
- 연속 봉합사 패턴을 사용하여 3-0 실크 비흡수성 봉합사를 사용하여 피부 절개 부위를 봉합합니다. 봉합사가 카테터 주위에 묶여 있는지 확인하여 당겨질 경우 혈류가 제한되지 않도록 합니다. 미리 세척된 카테터를 자궁에 삽입하고 3-0 비흡수성 실크 봉합사를 사용하여 봉합사로 태아에 고정합니다.
5. 태아를 다시 눕히고 상처를 봉합합니다.
- 태아를 자궁으로 되돌려 놓는다. 연속 잠금(쿠싱) 패턴이 있는 3-0 비흡수성 실크 봉합사를 사용하여 태아막을 봉합합니다. 3-0 비흡수성 실크 봉합사를 사용하여 자궁 근육층을 닫습니다.
- 18인치 스테인리스 스틸 수술용 막대를 복벽을 따라 늑골 주위 부위까지 피하로 삽입합니다. 막대의 근위 끝이 1cm 절개를 수행하여 주위 늑골 부위를 빠져나가도록 합니다.
- 수술용 막대의 말단 끝에 카테터를 부착하고 보조자가 막대를 주늑골 개구부를 통해 막대를 완전히 밀어 늑골 주위 출구 부위를 통해 카테터와 플로우 프로브 케이블을 공급하도록 합니다.
- 모든 카테터와 플로우 프로브 케이블을 주위 늑골 절개 부위에 고정합니다. 방수 테이프로 붙이고 카테터를 암양의 피부에 봉합합니다. 플라스틱 메쉬 파우치를 암양 외부에 봉합하여 카테터와 프로브를 보관합니다.
- 1-0 모노필라멘트 합성 흡수성 봉합사 재료를 사용하여 연속 패턴으로 linea alba를 고정합니다. 수술용 스테이플로 피부층을 고정합니다.
- 전신 마취를 중단하고 후두 반사가 정상 기준선으로 돌아오면 암양을 발관합니다. 동물이 완전한 의식을 회복할 때까지 방치하지 마십시오. 암양이 전신 마취 후 안정되면 대사 카트로 이동합니다. 마취에서 완전히 회복된 후 동물을 수술 후 실험실로 돌려보냅니다.
- 수술 후 진통제를 3일 동안 정맥 주사(10mg/kg/일 페닐부타존)로 투여합니다. 헤파린화 식염수(0.9% NaCl 용액에 100U/mL 헤파린)로 혈관 카테터를 매일 세척합니다.
6. 수술 후 생체 내 실험
- 매일 헤파린화 식염수(75U/ml)로 카테터를 세척합니다. 측정하기 전에 72시간 동안 기다리십시오. 혈류를 측정하려면 혈관 주위 유동 모듈과 함께 태아에 삽입된 유동 프로브를 PowerLab과 연결된 컴퓨터에 부착합니다.
알림: 기록은 PowerLab 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 수행하여 경동맥 및 대퇴 혈류를 측정할 수 있습니다. 30분 동안 기준선 측정을 수행합니다. - 동맥 및 양수 카테터를 아날로그-디지털 변환기에 부착된 브리지 증폭기에 부착합니다( 재료 표 참조). 10uM 페닐에프린 1mL 볼루스를 태아에게 정맥 주사하고 15분 동안 경동맥 및 대퇴골 흐름을 측정합니다. 그런 다음 30분 동안 또는 혈류가 기준선으로 돌아올 때까지 기다립니다.
- 1mL의 10uM 페닐에프린을 혈관 주위 카테터에 주입하고 15분 동안 혈류를 측정합니다. 혈관 주위 카테터를 통해 5mL의 따뜻한 식염수를 투여하여 페닐에프린을 씻어냅니다. 그런 다음 30분 동안 또는 혈류가 기준선으로 돌아올 때까지 기다립니다.
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Representative Results
혈류의 국소 생체 내 조작을 조사하기 위해 α1-AR 작용제인 페닐에프린(10μM) 1mL를 외부 주입 카테터에 의해 경동맥의 혈관 주위 공간에 투여하여 국소 경동맥 혈류에 대한 영향 및 전신 혈압에 대한 영향을 확인했습니다. 그림 1A 는 단기 태아 양의 전신 혈압에 영향을 미치지 않고 경동맥 혈류가 현저히 감소했음을 보여줍니다. 그림 1B 는 미숙아에 대한 동일한 데이터를 보여줍니다. IV 경로로 1mL의 PHE를 투여하면 단기 태아 양의 경동맥 혈류에 영향을 주지 않고 전신 혈류가 증가했습니다(그림 1C). 그림 1D 는 미숙아에 대한 동일한 데이터를 보여줍니다. 대조적으로, 혈관 주위 카테터에 의한 PHE의 투여는 조산양에서 아무런 효과가 없었다. 그러나 정맥 투여 경로에 의한 투여는 경동맥 혈류와 전신 혈압을 모두 크게 증가시켰습니다. 이 실험은 전신 혈압에 영향을 주지 않고 자궁 내 경동맥의 혈류를 조절할 수 있는 완전한 기능의 혈관 주위 슬리브를 보여줍니다. 결과는 조산아가 페닐에프린 매개 경동맥 혈류 조절에 반응하지 않는다는 것을 보여줍니다. 그러나 그 반응은 단기 태아에서 성숙하다(그림 1E). 중요한 것은 PHE의 IV 투여가 미숙아 태아에서만 경동맥 혈류를 증가시켰고 단기 태아에서는 유의한 효과가 없었다는 것입니다(그림 1G). 그러나 PHE의 IV 투여는 조산 및 단기 태아 모두의 전신 혈압을 높였습니다(그림 1H). 결과는 또한 페닐에프린의 혈관 주위 점안이 전신 혈압에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다(그림 1F).
그림 1: 혈류의 생체 내 조작. (A) 자궁 내 근월 태아 및 (B) 자궁 내 조산 태아로부터 혈관 주위 카테터를 통한 페닐에프린(PHE) 투여에 따른 전신 혈압 및 경동맥 혈류 기준선 측정 및 변화의 예시적인 추적. (C) 자궁 내 근기 태아 및 (D) 자궁 내 조산 태아로부터 페닐에프린(PHE)의 정맥 투여 후 전신 혈압 및 경동맥 혈류 기준선 측정 및 변화의 예시적인 추적. 단기 및 조산아의 혈관 주위 카테터 전달 시스템을 통한 경동맥 혈류의 (E) 비율과 (F) 전신 혈압의 변화를 보여줍니다. 단기 및 조산아에 대한 전신 투여를 통한 경동맥 혈류의 (G) 백분율과 (H) 전신 혈압의 변화를 보여줍니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 각 그룹에서 N = 4입니다. *P< 스튜던트 t-검정에 의해 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재, 약물 화합물 및 유전자 조작에 반응하여 생체 내에서 혈관 수축성 및 팽창을 검사하는 방법은 존재하지 않습니다. 현장의 표준으로 in vivo 혈류는 도플러 유량 프로브, 마이크로스피어 및 삼중수와 같은 방사성 분자에 의해 측정됩니다. 그러나 수용체의 기능이나 다운스트림 신호 전달을 조작하기 위해 동물을 희생시키고 동맥 분절을 분리한 후 장기 목욕에서 시험관 내에서 실험을 수행합니다. 현재의 방법은 유전자 발현을 수정하기 위해 화학물질 또는 벡터를 도입하여 동맥 분절의 생체 내 조작을 수행하는 방법을 제공합니다. 더욱이, 이 방법은 약제의 국소 전달로 인해 전신 순환에 미치는 영향이 최소화됩니다.
현재 실험은 페닐에프린의 투여가 혈류의 감소와 함께 경동맥의 수축을 초래한다는 것을 보여줍니다. 위의 연구는 뇌로 가는 경동맥 혈류를 조절하는 알파-아드레날린 수용체의 역할을 설명합니다. 이 기술은 살아있는 태아의 혈류에 대한 다양한 약리학적 화합물의 영향을 실시간으로 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 혈관 주위 카테터는 혈관 주위 공간에 렌티바이러스를 주입하는 데에도 사용할 수 있으며, 렌티바이러스는 혈관 조직에 의해 흡수되어 원하는 신호 전달 단백질 또는 수용체의 녹다운 또는 과발현을 초래할 수 있습니다.
수십 년 동안 장기 및 조직 수조는 혈관 수축성에 관한 유용한 데이터를 제공해 왔다 6,8,9. 그러나 이러한 연구는 생체 외(ex vivo)이므로 생체 내 재현성에 대한 의문이 제기되고 지속적인 측정을 수행할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이 혁신적인 접근법은 생체 내 경동맥 혈류를 검사합니다. 이 방법론의 또 다른 발전에는 바이러스 전달 접근법을 사용한 유전자 조절의 채택이 포함될 것이며, 이를 통해 동맥 분절이 shRNA 또는 CRISPR/Cas9을 전달하여 유전자 발현을 상향 조절 및 하향 조절하도록 유전적으로 변형될 수 있습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 혈관 주위 카테터를 혈관과 평행하게 가깝게 배치하는 것입니다. 이것이 작동하려면 표적 동맥의 직경을 알아야 합니다. 또한 적절한 슬리브를 개발하는 것이 중요합니다. 슬리브를 둘러싸는 대신 조절할 동맥에 인접하게 배치할 수 있습니다. 이것은 또한 화학 물질 및 표적 제제의 현지 배송을 제공할 것입니다.
이 방법의 한계는 동맥의 한 부분만 조절한다는 것이며, 장기 또는 조직 혈류에 관한 결과는 신중하게 해석해야 합니다. 원하는 효과를 얻기 위해 슬리브의 길이와 화학 물질의 양을 변경해야 할 수도 있습니다. 이 방법은 살아있는 태아의 유전자 조절을 조절하는 데 광범위하게 적용됩니다. 이것은 어떤 조직의 부분든지에 있는 유전자 기능 그리고 표정을 조절하기 위하여 적응시킬 수 있습니다. 또한, 이 방법은 성체 유기체에서 유전자 발현을 조절하는 데 적용될 수 있습니다.
천음속 유동 프로브(10), 레이저 도플러(11) 및 마이크로스피어(12)를 사용하는 것과 같은 생체내 혈류를 측정하는 다른 방법들이 있지만, 이러한 방법들 중 어느 것도 중재의 전신 효과와 반대로 동맥 분절의 혈류에 대한 약물의 국소적 효과를 검사하는 것을 허용하지 않는다. 따라서 현재 방법은 전신 영향 없이 국소 혈류를 측정하고 조절할 수 있기 때문에 독특합니다.
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Disclosures
저자는 공개하지 않습니다.
Acknowledgments
애리조나 대학의 교내 기금이 이 연구에 사용되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A.
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