Summary
El presente protocolo describe un método para administrar fármacos y agentes modificadores de la expresión génica por vía perivascular en un feto en desarrollo intrauterino . Es importante destacar que el efecto de los fármacos/agentes sobre el flujo sanguíneo puede medirse con la progresión del embarazo.
Abstract
La capacidad de un organismo para mantener un flujo sanguíneo constante al cerebro en respuesta a aumentos repentinos de la presión arterial sistémica (PA) se conoce como autorregulación cerebral (CAR), que se produce en la arteria carótida. A diferencia de los recién nacidos a término, los recién nacidos prematuros son incapaces de reducir el flujo sanguíneo cerebral (CBF) en respuesta al aumento de la presión arterial sistémica. En los recién nacidos prematuros, esto expone los frágiles vasos cerebrales a altas presiones de perfusión, lo que lleva a su ruptura y daño cerebral. Los estudios ex vivo que utilizan miografía en alambre han demostrado que las arterias carótidas de fetos a corto plazo se contraen en respuesta a la activación de los receptores alfa1 adrenérgicos. Esta respuesta se ve atenuada en el feto prematuro. Por lo tanto, para examinar el papel de alfa1-AR in vivo, se presenta aquí un enfoque innovador para determinar los efectos de los fármacos en un segmento arterial carotídeo in vivo en un feto ovino durante la progresión del desarrollo de la gestación. Los datos presentados demuestran la medición simultánea del flujo sanguíneo fetal y la presión arterial. El sistema de administración perivascular se puede utilizar para realizar un estudio a largo plazo durante varios días. Las aplicaciones adicionales de este método podrían incluir sistemas de administración viral para alterar la expresión de genes en un segmento de la arteria carótida. Estos métodos podrían aplicarse a otros vasos sanguíneos en el organismo en crecimiento en el útero , así como en organismos adultos.
Introduction
El parto causa estrés al feto, y hay un aumento considerable en los niveles de catecolaminas, la principal hormona del estrés 1,2. Esto eleva la PA sistémica, y si esta presión se transmite a los frágiles capilares cerebrales a través de las arterias carótidas, esto puede llevar a su ruptura 3,4,5. Los aumentos repentinos de la presión arterial sistémica evitan que lleguen al cerebro mediante la constricción de las arterias carótidas en el feto a término. Sin embargo, este mecanismo no está desarrollado en el feto prematuro, y esto es responsable de la probabilidad significativamente mayor de daño cerebral en los fetos prematuros 4,5.
En la actualidad, no existe un método adecuado para examinar la maduración de las vías implicadas en la regulación del flujo sanguíneo carotídeo en fetos en desarrollo. Estos estudios sobre el flujo sanguíneo carotídeo y la vasorreactividad son cruciales tanto desde el punto de vista de la ciencia básica como desde el punto de vista clínico. Actualmente, para determinar las vías moleculares implicadas en la regulación de la contractilidad arterial, el método estándar consiste en aislar los segmentos arteriales postmortem. A continuación, los experimentos se llevan a cabo mediante miografía en alambre para determinar la vasocontractilidad de diferentes moléculas farmacológicas que definen las vías reguladoras implicadas en la contractilidad arterial 6,7. Cabe destacar que los hallazgos ex vivo no son capaces de replicar completamente el entorno in vivo debido a la regulación del flujo sanguíneo aguas arriba y aguas abajo de la arteria carótida. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una técnica que pueda determinar los efectos de sustancias químicas o agentes vasosensibles sobre el flujo sanguíneo en una arteria in vivo.
La metodología de administración perivascular descrita en este artículo proporciona un enfoque in vivo para estudiar el efecto de la manipulación farmacológica o genética de las vías de señalización en diferentes segmentos arteriales. Con este método, se puede manipular la presión arterial fetal y el flujo sanguíneo carotídeo. Además, se demuestran experimentos con fetos de ovejas para estudiar los efectos de las moléculas de señalización en un feto en desarrollo. Es de esperar que la metodología detallada proporcionada conduzca a nuevas investigaciones en el campo de los estudios del flujo sanguíneo, especialmente en relación con la fisiología y la patología fetal.
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Protocol
Para el presente estudio, se obtuvo la aprobación de los experimentos con animales por parte del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arizona. Para el presente estudio se utilizaron ovejas Columbia-Rambouillet preñadas de entre 2 y 4 años de edad. Los animales fueron obtenidos de la Unidad de Ovejas de la Universidad de Arizona.
1. Mantenimiento de los animales
- Consigue animales de cualquier rancho de ovejas.
- Transportar las ovejas al laboratorio a los 105 días ± 5 días a los 137 días ± 5 días de edad gestacional (dGA). Mantener las ovejas a una temperatura de 22 °C ± 1 °C en humedad ambiente. Proporcione gránulos de alfalfa (consulte la Tabla de materiales), sales y agua ad libitum.
2. Preparación del material
- Construir el sistema de catéter perivascular.
- Conecte un extremo de 4 pies de tubería Tygon a una tubería de bomba de colector (MPT) de 2 cm (consulte la Tabla de materiales). Conecte el otro extremo del MPT de 2 cm a otros 4 pies de tubo Tygon.
- Haga una pequeña hendidura en el MPT para que el líquido/agentes puedan salir al espacio perivascular.
- Esterilice las sondas de flujo (consulte la Tabla de materiales), los catéteres y un destornillador pequeño utilizando el método de esterilización por gas.
3. Preparación prequirúrgica de los animales
- Obtener la aprobación para experimentos con animales del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
- Antes de la cirugía, mantenga a las ovejas con comida sin alcohol (NPO) durante 24 h y agua NPO durante 16 h. El día de la cirugía, envuelva la cara de la oveja con una almohadilla para proteger sus ojos. Afeitar el lado izquierdo del cuello para exponer la vena yugular y limpiar la piel con povidona yodada y etanol al 70%.
- Coloque un catéter intravenoso (IV) en la vena yugular de la oveja y fíjelo a la piel con cinta impermeable y clips para heridas (consulte la Tabla de materiales).
- Anestesiar a las ovejas con una administración intravenosa de diazepam (0,15 mg/kg) y clorhidrato de ketamina (16 mg/kg). Administrar una inyección IM de penicilina G procaína en suspensión (25.000 I/kg) y ketoprofeno IV (2,2 mg/kg) (ver Tabla de Materiales).
- Afeite el sitio de la incisión de la oveja y las áreas circundantes (abdomen, flancos e ingle) con una tijera de cuchillas # 10. Para asegurarte de que la lana se haya eliminado por completo, vuelve a afeitar el área con una cuchilla #40. Lave el área afeitada con un limpiador germicida (consulte la Tabla de materiales) y agua. Secar con una almohadilla desechable.
- Confirme la profundidad de la anestesia (determinada y mantenida por la respuesta al pellizco de la piel, el reflejo corneal y la evaluación del tono de la mandíbula) y luego intuble a la oveja con un tubo endotraqueal de 6,5-7,5 mm de diámetro interior (ver Tabla de materiales) y asegure el tubo en su lugar. Coloque a la oveja en una mesa elevadora en decúbito lateral y transfiérala a una mesa quirúrgica en decúbito supino a una mesa quirúrgica con tapa en V.
- Asegure las extremidades de la oveja a la mesa quirúrgica V-top con amarres quirúrgicos. Coloque a la oveja en la posición de Trendelenburg para aliviar la presión sobre la unidad fetal-placentaria.
- Coloque una sonda de oxímetro de pulso (consulte la Tabla de materiales) en la lengua/oído de la oveja para controlar continuamente la saturación de oxihemoglobina y la frecuencia cardíaca. Coloque un termómetro debajo de la lengua de la oveja para controlar la temperatura.
- Conecte el tubo endotraqueal al circuito respiratorio de la máquina de anestesia e inicie la ventilación mecánica mientras monitorea elCO2 espirado.
- Mantenga la anestesia ajustando el isoflurano entre 2,5% y 4% durante toda la cirugía. Asegúrese de que el animal esté adecuadamente anestesiado pellizcando la oreja. Administrar una solución poliiónica balanceada (solución salina al 0,9% p/v) a 5 mL/kg/h utilizando el catéter yugular colocado durante el paso 3.2.1.
- Realice un lavado estéril. Pulverizar la zona abdominal y los flancos con solución de povidona (solución de yodo al 10%). Frote el área con una gasa empapada en yodo comenzando desde el sitio de la incisión y trabajando hacia afuera, asegurándose de no volver al centro después de frotar hacia afuera.
- A continuación, rocíe el área con etanol (70% de etanol p/v) y frote con una gasa empapada en etanol de manera similar al fregado con povidona. Repite todo el proceso tres veces. Rocíe el área con una solución de povidona.
- Calentar solución salina en un recipiente estéril y llevarla a 37 °C. Manténgalo cerca de la mesa quirúrgica. Conecte el cauterio (consulte la Tabla de materiales).
- Haga que los miembros del equipo quirúrgico se vistan con gorros, mascarillas y cubrezapatos, que se laven las manos (bata quirúrgica) y que se pongan batas y guantes quirúrgicos esterilizados. A partir de este momento, se debe seguir una estricta práctica quirúrgica estéril.
- Cubra el área abdominal de la oveja esterilizada con toallas estériles.
4. Procedimiento quirúrgico
- Exteriorización del feto
- Después de asegurar una profundidad adecuada de anestesia, realice una incisión de laparotomía estándar de 10 cm con un bisturí (hoja #20) sobre la línea alba desde el ombligo hasta la porción craneal de la ubre. Controle el sangrado mientras realiza una incisión con una cauterización (ajustes de potencia: 50 de corte y 25 de coagulación).
- Haga una pequeña incisión a través de la línea media de la pared del cuerpo debajo de la incisión en la piel y abra la cavidad abdominal con unas tijeras Metzenbaum (consulte la tabla de materiales).
- Exteriorizar el útero que contiene al feto a través de la pared abdominal mientras se colocan toallas quirúrgicas estériles debajo (entre el abdomen materno y el útero). Palpar el útero para determinar la posición fetal y los cotiledones. Con una cauterización, haga una incisión de ~ 10 cm a través de la pared uterina con una gran curvatura sobre el dorso de la cabeza, evitando los vasos sanguíneos y los placentomas visibles.
- Utilice cuatro pinzas Babcock (consulte la tabla de materiales) para asegurar el útero y las membranas placentarias, y tire de las pinzas Babcock en las cuatro esquinas opuestas para que la cabeza del feto sea visible. Exteriorice la mitad craneal del feto a través de esta incisión y cubra la cabeza fetal con un guante estéril sin látex lleno de solución salina tibia y estéril (37 °C) para evitar el inicio de la respiración.
- Después de asegurar una profundidad adecuada de anestesia, realice una incisión de laparotomía estándar de 10 cm con un bisturí (hoja #20) sobre la línea alba desde el ombligo hasta la porción craneal de la ubre. Controle el sangrado mientras realiza una incisión con una cauterización (ajustes de potencia: 50 de corte y 25 de coagulación).
- Instrumentación del catéter perivascular de la arteria carótida
- Al extraer la cabeza fetal del útero, pídale a un asistente que sostenga suavemente las pinzas de Babcock en posición vertical para minimizar la pérdida de líquido amniótico. Con el cuello del feto expuesto, realice una incisión cutánea oblicua de 3-3,5 cm a lo largo del borde anterior del músculo esternocleidomastoideo (SCM) en un lado del cuello en la región media, y separe la fascia con pinzas para mosquitos.
- Divida el platisma y realice una disección a lo largo del borde medial del músculo SCM desde su tendón superior hasta el nivel del músculo omohioideo inferiormente. La retracción del SCM expondrá la lámina carotídea, que superficialmente contiene una vena yugular interna de paredes delgadas, y debajo de ella estará la arteria carótida como un vaso de paredes gruesas.
- Retraiga la piel con pinzas Babcock y realice una disección roma para liberar la arteria carótida del tejido circundante y de la lámina carotídea.
- Tome la sonda de flujo de 3 mm (consulte la Tabla de materiales) del paquete estéril, desenrosque la placa de respaldo de la sonda y deslícela para abrirla para exponer el soporte en L. Levante con cuidado la arteria carótida y enganche suavemente el bracket debajo del vaso mientras evita el contacto con el vaso.
- Use pinzas para cerrar el soporte de la sonda de flujo deslizando suavemente la placa de respaldo a una posición cerrada. Asegure el soporte de la sonda de flujo apretando el tornillo de respaldo de la sonda de flujo. Para facilitar este proceso, sujete suavemente los extremos de la sonda de flujo con pinzas para estabilizar la sonda de flujo mientras se aprieta el tornillo.
- Enjuague previamente el catéter perivascular y colóquelo en las proximidades de la arteria carótida proxima a la sonda de flujo. Asegúrese de que la hendidura abierta del catéter perivascular esté muy cerca de la arteria carótida.
- Con una sutura no absorbible de seda 3-0, asegure los extremos proximal y distal del sistema perivascular y la sonda de flujo al tejido intersticial cercano. Cierre el sitio de la incisión con un punto de sutura continuo, cierre la piel fetal con una sutura no absorbible de seda 3-0 y asegure los catéteres a la piel envolviendo la sutura alrededor del catéter tres veces. Retire el guante y vuelva a colocar la cabeza del feto en el útero.
- Al extraer la cabeza fetal del útero, pídale a un asistente que sostenga suavemente las pinzas de Babcock en posición vertical para minimizar la pérdida de líquido amniótico. Con el cuello del feto expuesto, realice una incisión cutánea oblicua de 3-3,5 cm a lo largo del borde anterior del músculo esternocleidomastoideo (SCM) en un lado del cuello en la región media, y separe la fascia con pinzas para mosquitos.
- Cateterismo de extremidades fetales
- Exteriorizar la pata trasera del feto. Sostenga la pierna y gírela hacia los lados para visualizar el área interna del muslo. Limpie el área con una gasa estéril, realice una incisión de 2 cm y exponga la arteria femoral. Coloque y asegure la sonda de flujo siguiendo un procedimiento similar al que se realiza con la carótida, y luego cierre la incisión.
- Hacer una incisión de 2 cm a lo largo de la cara medial de la tibia ~0,5 cm distal a la rodilla. Exponga la arteria tibial posterior (de paredes gruesas) y la vena safena (de paredes delgadas). Inserte catéteres de polivinilo (diámetro exterior: 1,4 mm y diámetro interior: 0,9 mm) en la arteria tibial posterior y la vena safena utilizando una técnica de corte estándar, como se menciona a continuación:
- Libere el vaso de interés con una disección roma. Ligar la porción distal del vaso con una sutura de seda 3-0 (sin aguja) usando un nudo cuadrado con tres lanzamientos. Coloque previamente una segunda atadura sin seda en la cara proximal del vaso (debajo del vaso), pero deje la ligadura desatada. Con las tijeras Castroviejo (ver Tabla de Materiales), realizar una pequeña incisión transversal en el vaso 2 mm proximal a la ligadura distal. La longitud del corte debe ser ~25% del diámetro del recipiente.
- Restrinja el flujo sanguíneo de los vasos tirando suavemente hacia arriba de la sutura proximal desatada. Llene el catéter con solución salina heparinizada estéril. Inserte el extremo biselado del catéter y avance la punta 20 cm dentro del vaso fetal.
- Sostenga el catéter en su lugar con fórceps mientras un asistente ata la sutura de seda proximal para asegurar el vaso al catéter; Ligar el vaso completamente alrededor del catéter insertado con nudos cuadrados a 2 mm del sitio de inserción con tres lanzamientos. Amarre la ligadura distal proximal a la ligadura proximal que asegura el vaso al catéter.
- Cierre la incisión en la piel con una sutura de seda no absorbible 3-0 con un patrón de sutura continua. Asegúrese de que las suturas estén atadas alrededor de los catéteres para evitar restringir el flujo sanguíneo si se tira. Coloque un catéter previamente enjuagado en el útero y asegúrelo al feto mediante una sutura con una sutura de seda no absorbible 3-0.
5. Volver a colocar el feto y cerrar la herida
- Regrese el feto al útero. Suturar las membranas fetales utilizando suturas de seda no absorbibles 3-0 con un patrón de bloqueo continuo (Cushing). Cierre la capa muscular uterina con una sutura de seda no absorbible 3-0.
- Inserte una varilla quirúrgica de acero inoxidable de 18 pulgadas por vía subcutánea a lo largo de la pared abdominal hasta la región paracostal. Deje que el extremo proximal de la varilla salga del sitio paracostal realizando una incisión de 1 cm.
- Coloque los catéteres en el extremo distal de la varilla quirúrgica y pídale a un asistente que alimente los catéteres y el cable de la sonda de flujo a través del sitio de salida paracostal empujando la varilla completamente a través de la abertura paracostal.
- Asegure todos los catéteres y los cables de la sonda de flujo en el sitio de la incisión paracostal. Colocar con cinta impermeable, y suturar los catéteres a la piel de la oveja. Suturar una bolsa de malla de plástico en el exterior de la oveja sobre los catéteres y la sonda para almacenar los catéteres.
- Usando un material de sutura absorbible sintético monofilamento 1-0, asegure la línea alba con un patrón continuo. Asegure la capa de piel con grapas quirúrgicas.
- Detenga la anestesia general y extube a la oveja una vez que los reflejos laríngeos hayan vuelto a la línea de base normal. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia por completo. Mueva a la oveja al carro metabólico una vez que esté estable después de la anestesia general. Regrese el animal a la sala de experimentos postoperatorios después de recuperarse completamente de la anestesia.
- Administrar analgésicos postoperatorios por vía intravenosa (10 mg/kg/día de fenilbutazona) durante 3 días. Enjuague los catéteres vasculares diariamente con solución salina heparinizada (100 U/ml de heparina en solución de NaCl al 0,9%).
6. Experimentos postoperatorios in vivo
- Enjuague los catéteres todos los días con solución salina heparinizada (75 U/ml). Espere 72 h antes de realizar cualquier medición. Para medir el flujo sanguíneo, conecte las sondas de flujo insertadas en el feto con el módulo de flujo perivascular a PowerLab y a una computadora conectada.
NOTA: Los registros se pueden realizar en el software PowerLab (consulte la Tabla de materiales) para medir el flujo sanguíneo carotídeo y femoral. Tome la medida de referencia durante 30 minutos. - Conecte los catéteres arteriales y amnióticos al amplificador de puente conectado a un convertidor de analógico a digital (consulte la Tabla de materiales). Administrar un bolo de 1 ml de fenilefrina de 10 uM al feto por vía intravenosa y medir el flujo carotídeo y femoral durante 15 min. Luego, espere 30 minutos o hasta que el flujo sanguíneo vuelva a la línea de base.
- Infundir 1 ml de fenilefrina de 10 uM en el catéter perivascular y medir el flujo sanguíneo durante 15 minutos. Lave la fenilefrina administrando 5 ml de solución salina tibia a través del catéter perivascular. Luego, espere 30 minutos o hasta que el flujo sanguíneo vuelva a la línea de base.
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Representative Results
Para examinar la manipulación localizada in vivo del flujo sanguíneo, se administró 1 mL de fenilefrina (10 μM), un agonista α1-AR, en el espacio perivascular de la arteria carótida mediante un catéter de infusión exteriorizado para determinar el efecto sobre el flujo sanguíneo carotídeo local y el efecto sobre la presión arterial sistémica. La figura 1A demuestra una reducción significativa del flujo sanguíneo carotídeo sin ningún efecto sobre la presión arterial sistémica en ovejas fetales a corto plazo. La figura 1B muestra los mismos datos para un feto prematuro. La administración de 1 mL de PHE por vía intravenosa aumentó el flujo sanguíneo sistémico sin afectar el flujo sanguíneo carotídeo en ovejas fetales a corto término (Figura 1C). La figura 1D muestra los mismos datos para un feto prematuro. Por el contrario, la administración de PHE mediante catéter perivascular no tuvo ningún efecto en las ovejas pretérmino; sin embargo, la administración por vía intravenosa provocó un aumento significativo tanto del flujo sanguíneo carotídeo como de la PA sistémica. Este experimento demuestra una manga perivascular completamente funcional que puede regular el flujo sanguíneo en la arteria carótida en el útero sin afectar la PA sistémica. Los resultados muestran que los fetos prematuros no responden a la regulación del flujo sanguíneo carotídeo mediada por fenilefrina; sin embargo, la respuesta es madura en los fetos a corto plazo (Figura 1E). Es importante destacar que la administración intravenosa de PHE aumentó el flujo sanguíneo carotídeo solo en fetos prematuros, sin un efecto significativo en fetos a corto plazo (Figura 1G). Sin embargo, la administración intravenosa de PHE elevó la presión arterial sistémica tanto en fetos prematuros como a corto plazo (Figura 1H). Los resultados también demuestran que la instilación perivascular de fenilefrina no tuvo ningún efecto sobre la presión arterial sistémica (Figura 1F).
Figura 1: Manipulación in vivo del flujo sanguíneo. Un rastro ejemplar de las mediciones basales de la presión arterial sistémica y del flujo sanguíneo de la arteria carótida y los cambios después de la administración de fenilefrina (PHE) a través del catéter perivascular de (A) un feto intrauterino a corto término y (B) un feto prematuro intrauterino . Un rastro ejemplar de la presión arterial sistémica y las mediciones basales del flujo sanguíneo de la arteria carótida y los cambios después de la administración intravenosa de fenilefrina (PHE) de (C) un feto intrauterino a corto término y (D) un feto prematuro intrauterino . Se muestran los cambios en el porcentaje (E) del flujo sanguíneo carotídeo y (F) la presión arterial sistémica a través del sistema de administración de catéteres perivasculares para ovejas a corto plazo y pretérmino. Se muestran los cambios en el porcentaje (G) del flujo sanguíneo carotídeo y (H) la presión arterial sistémica a través de la administración sistémica para ovejas a corto plazo y pretérmino. Las barras de error muestran el error estándar de la media. N = 4 en cada grupo. *P < 0.05 en la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En la actualidad, no existe ningún método para examinar la contractilidad y la dilatación de los vasos in vivo en respuesta a compuestos farmacológicos y manipulación génica. Como estándar en el campo, el flujo sanguíneo in vivo se mide mediante sondas de flujo Doppler, microesferas y moléculas radiactivas como el agua tritiada. Sin embargo, para manipular las funciones de los receptores o la señalización posterior, los animales son sacrificados y los experimentos se llevan a cabo in vitro en baños de órganos después del aislamiento de los segmentos arteriales. Los métodos actuales proporcionan una forma de llevar a cabo manipulaciones in vivo de segmentos arteriales mediante la introducción de sustancias químicas o vectores para modificar la expresión génica. Además, este método tiene un efecto mínimo sobre la circulación sistémica debido a la administración local de los agentes.
Los experimentos actuales demuestran que la administración de fenilefrina provoca la constricción de la arteria carótida con una reducción del flujo sanguíneo. La investigación anterior aclara el papel de los receptores alfa-adrenérgicos en la regulación del flujo sanguíneo de la arteria carótida al cerebro. Esta técnica se puede utilizar para examinar el efecto de diferentes compuestos farmacológicos sobre el flujo sanguíneo en tiempo real en fetos vivos. El catéter perivascular también se puede utilizar para instilar lentivirus en el espacio perivascular, que es ocupado por la vasculatura, para dar lugar a la eliminación o sobreexpresión de la proteína o receptor de señalización deseado.
Durante décadas, los baños de órganos y tejidos han proporcionado datos útiles sobre la contractilidad de los vasos 6,8,9. Sin embargo, estos estudios son ex vivo, lo que plantea dudas sobre la reproducibilidad in vivo y significa que no se pueden realizar mediciones continuas. Para superar esta limitación, este enfoque innovador examina el flujo sanguíneo de la arteria carótida in vivo. Un avance adicional en esta metodología incluirá la adopción de la modulación genética mediante enfoques de administración de virus, lo que permitirá alterar genéticamente los segmentos arteriales para regular al alza y a la baja la expresión génica mediante la administración de shRNA o CRISPR/Cas9.
El paso crítico en el protocolo es colocar el catéter perivascular paralelo al vaso en las proximidades. Para que esto funcione, es necesario conocer el diámetro de la arteria objetivo. Además, es importante desarrollar una manga adecuada. Se puede colocar el manguito adyacente a la arteria a modular en lugar de rodearla. Esto también proporcionará la entrega local de los productos químicos y los agentes de focalización.
La limitación del método es que solo regula un segmento de la arteria, y los resultados con respecto al flujo sanguíneo de órganos o tejidos deben interpretarse cuidadosamente. Es posible que sea necesario cambiar la longitud de la manga y la cantidad de productos químicos para lograr el efecto deseado. El método tiene amplias aplicaciones en la modulación de la regulación génica en fetos vivos. Esto se puede adaptar para modular la función y la expresión génica en una parte de cualquier tejido. Además, el método se puede aplicar para modular la expresión génica en un organismo adulto.
Aunque existen otros métodos para medir el flujo sanguíneo in vivo , como el uso de sondas de flujo transónico10, Dopplerláser 11 y microesferas12, ninguno de esos métodos permite examinar el efecto local de los fármacos sobre el flujo sanguíneo en el segmento arterial en comparación con los efectos sistémicos de la intervención. Por lo tanto, el método actual es único, ya que puede medir y modular el flujo sanguíneo local sin ningún efecto sistémico.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Para estos estudios se utilizaron fondos internos de la Universidad de Arizona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A.
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
