Микрозонд внутритканевой радиометрии для измерения яркости in situ в живой ткани
Summary
В данной работе описан метод измерения яркости in situ в живой ткани. Эта работа включает в себя детали конструкции микромасштабных зондов для различных измерений яркости и освещенности, дает рекомендации по монтажу ткани для характеристики яркости и описывает вычислительные методы анализа полученных данных.
Abstract
Организмы кажутся непрозрачными в основном потому, что их внешние слои тканей сильно рассеиваются на падающий свет; Сильно поглощающие пигменты, такие как кровь, обычно имеют узкое поглощение, так что средний свободный путь света за пределами пиков поглощения может быть довольно длинным. Поскольку люди не могут видеть сквозь ткани, они обычно воображают, что такие ткани, как мозг, жир и кости, содержат мало света или вообще не содержат его. Однако фоточувствительные белки опсина экспрессируются во многих из этих тканей, и их функции плохо изучены. Внутреннее сияние ткани также важно для понимания фотосинтеза. Например, гигантские моллюски сильно поглощают, но сохраняют плотную популяцию водорослей глубоко в тканях. Распространение света через такие системы, как отложения и биопленки, может быть сложным, и эти сообщества могут вносить основной вклад в продуктивность экосистем. Поэтому был разработан метод построения оптических микрозондов для измерения скалярного излучения (поток фотонов, пересекающий точку) и нисходящего излучения (поток фотонов, пересекающий плоскость перпендикулярно), чтобы лучше понять эти явления внутри живой ткани. Этот метод также поддается лечению в полевых лабораториях. Эти микрозонды изготовлены из нагретых оптических волокон, которые затем закрепляются в стеклянных пипетках. Чтобы изменить угловую приемку зонда, сфера размером 10-100 мкм из УФ-отверждаемой эпоксидной смолы, смешанной с диоксидом титана, затем прикрепляется к концу вытянутого обрезанного волокна. Зонд вводится в живую ткань, а его положение контролируется с помощью микроманипулятора. Эти зонды способны измерять излучение тканей in situ с пространственным разрешением 10-100 мкм или в масштабе отдельных клеток. Эти зонды были использованы для характеристики света, достигающего жировых и мозговых клеток на 4 мм ниже кожи живой мыши, и для характеристики света, достигающего аналогичных глубин в живой ткани гигантского моллюска, богатой водорослями.
Introduction
Удивительно, но наземные животные и мелководные обитатели океана имеют достаточно света в своем теле для визуальной физиологии и даже фотосинтеза. Например, уровни освещенности в центре головы мыши (за пределами сильных полос поглощения гемоглобина) ослабляются на три-четыре порядка относительно внешнего мира. Это примерно разница между уровнями освещенности в помещении и на улице. Таким образом, непрозрачность ткани или материала из-за сильного рассеяния — это не то же самое, что непрозрачность из-за сильного поглощения света. Свет может продолжать распространяться на большие расстояния в системе с сильным прямым рассеянием, подобно свету, распространяющемуся через водные системы с высокой концентрацией клеток и частиц1. Это наблюдение особенно заметно в свете того факта, что белки опсина почти повсеместно экспрессируются во всех тканях всех животных. Таким образом, важно понять, как и где свет ослабляется и рассеивается в живой ткани. Однако, в отличие от водных систем, с живой тканью невозможно погрузить прибор в толщу воды и получить измерения яркости и освещенности, и необходима новая техника.
Другие методы, ранее использовавшиеся для характеристики поглощающих и рассеивающих свойств живой ткани, включают измерение отражательной способности ткани и/или интегрирующие сферы2,3, микроскопические методы, такие как сканирующая конфокальная микроскопия4, измерение диффузии лазерного света на поверхности5 и методы моделирования, такие как переносизлучения Монте-Карло 6. Упомянутые экспериментальные методы часто требуют специфического, большого и дорогостоящего оборудования или подробных знаний о структуре ткани и, как правило, ограничены в своей способности характеризовать пространственную структуру света глубоко внутри ткани.
Существуют также аналогичные методы, основанные на зондах, которые используют иглу для подкожных инъекций для введения оптического волокна через ткань 7,8,9. По нашему опыту, модифицированные иглы эффективны при прокалывании тканей, но требуют значительного усилия и, как правило, разрывают нежные ткани при прохождении через плотно упакованные клетки. Поэтому эти иглы обычно требуют хирургической процедуры, чтобы вставить более миллиметра или около того в слой ткани. Описанный здесь способ с использованием смазанной, натянутой стеклянной опоры способен скользить между клетками с минимальным ранением тканей и без дополнительного хирургического вмешательства.
В этой рукописи представлен метод, вдохновленный работой Йоргенсона и его коллег по измерению света в водорослевых матах10,11 с использованием оптических микрозондов на основе стекла и портативной электроники, которые поддаются глубокому исследованию плотных тканей, а также созданию и использованию в полевых условиях. Эти зонды могут быть сконструированы для характеристики скалярного излучения (свет, падающий на точку со всех сторон) и нисходящего излучения (свет, пересекающий горизонтальную плоскость) внутри живой ткани с высоким пространственным разрешением. Эти зонды были первоначально разработаны для измерения переноса излучения в ткани фотосимбиотических гигантских моллюсков12. Стандартных измерений поглощения и пропускания всей ткани было недостаточно для характеристики фотосинтетических характеристик ткани, поскольку имеет большое значение, поглощается ли весь падающий свет несколькими клетками, испытывающими высокую интенсивность на поверхности ткани, или многими клетками, испытывающими низкую интенсивность по всему объему ткани. Во втором проекте эти зонды использовались для измерения излучения in vivo в мозге мыши13,14, тем самым характеризуя световую среду опсинов, экспрессируемых глубоко в мозге. Эти микрозонды одновременно малы и достаточно чувствительны, чтобы измерить излучение в ткани мозга мыши со всем неповрежденным мехом, кожей и костями и продемонстрировать, что физиологические уровни освещенности достаточно высоки, чтобы стимулировать опсины глубокого мозга.
Этот микрооптический зонд и измерительная установка могут быть полезны исследователям, нуждающимся в количественной оценке и характеристике света внутри биологической ткани, особенно для более тонкого понимания фотосинтеза или функций зрительных пигментов, экспрессируемых вне глаз. Этот метод может быть использован отдельно или в сочетании с другими методами для полной характеристики оптических свойств и распространения света в живой ткани при низких затратах, с небольшим портативным оборудованием, встроенным в дом, и с регулируемыми параметрами, зависящими от задачи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод систематической характеристики оптической среды через большой объем живой ткани с пространственным разрешением примерно в масштабе отдельных клеток. Этот недорогой, гибкий и управляемый в полевых условиях метод может быть полезен любым исследователям, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Саназа Вахидиниа за то, что он познакомил нас с коллегами доктора Йоргенсена и его работой. Это исследование было поддержано грантами Исследовательского управления армии (No W911NF-10-0139), Управления военно-морских исследований (через награду MURI No N00014-09-1-1053) и наградой NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393 (2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309 (2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316 (2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678 (2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
